高剂量单宁酸对小鼠肠道屏障和肠道菌群的影响

2022-06-09 08:48何亚伦曾丽荣刘雄张铃王琼
生物技术通报 2022年4期
关键词:单宁酸高脂屏障

何亚伦 曾丽荣 刘雄 张铃 王琼

(武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065)

单宁酸是一种水溶性多酚类物质,在自然界中广泛存在,具有抗癌、抗氧化、抗诱变、捕捉自由基、抑菌等特性,具有重要的开发利用价值[1]。目前它在食品加工、果蔬加工、贮藏、化妆品、医药和水处理等方面应用越来越广泛。近年来,单宁酸被发现在体内外多种肿瘤中都具有抗癌作用。如在体外的细胞实验中,单宁酸可以抑制多种癌细胞株的增殖,并且诱导癌细胞凋亡[2-6]。在动物实验方面,单宁酸和相关的绿茶多酚可以抑制小鼠乳腺肿瘤病毒的启动子[7-8]。还有研究发现单宁酸能抑制多环芳烃对鼠伤寒沙门氏菌和中国仓鼠V79细胞的致突变性,抑制多环芳烃和n -甲基-n -亚硝基脲对小鼠皮肤、肺和前胃的致瘤作用[9]。单宁酸还具有一定的抗诱变能力,其原因可能由于其良好的抗氧化特性可以减少反应代谢物的产生,同时降低其下游的部分有害影响[9-10]。据文献报道,单宁酸在药理方面也存在有益作用,如单宁酸可以通过其抗基因毒性和抗氧化潜能对抗顺铂(CP)诱导瑞士白化病小鼠的肾毒性和氧化应激[11]。

单宁酸通常被认为是一种抗营养因子,它可以与蛋白质、消化酶、生物碱、多糖和金属离子结合形成沉淀,减少动物对营养物质的消化吸收。单宁酸特别是大剂量单宁酸的急性毒性已被证实[12]。研究表明,单宁酸抑制动物肠道消化酶和营养物质吸收[13]。Hervás等[14]发现连续饲喂高剂量浓缩单宁(3.0 g/kg体重)10 d后,绵羊胃肠道黏膜出现溃疡、增厚、肿胀和大量水样。使用含有高含量单宁的高粱喂食老鼠后,其十二指肠壁的厚度和腺管的长度略减少,胃黏膜坏死,胆囊萎缩,肠上皮细胞耗氧量下降,肠内腔的形态和代谢有显著改变[15-16]。这些研究均表明,大剂量单宁酸对消化系统的损害与肠黏膜屏障密切相关,但其作用机制尚不完全清楚。

虽然单宁酸本身毒性很小,但是如果大量使用,可能会造成不可预知的后果。有研究表明,400 mg/mL缩合单宁可以抑制瘤胃内许多细菌的生长[17]。单宁酸能抑制幽门螺杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌的生长和定植[18]。但是,大剂量单宁酸对肠道菌群的影响还不清楚。因此,本研究以正常饮食小鼠和高脂饮食诱导肥胖模型小鼠为研究对象,并基于16S rRNA基因测序技术,分析高浓度单宁酸(400 mg/kg体重)对正常饮食及肥胖小鼠肠道屏障及肠道菌群的影响,为单宁酸的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

单宁酸(CAS号1401-55-4,相对分子质量为1 701.20)购买于Sigma公司;氯仿、异丙醇、甲醇、无水乙醇、二甲苯、盐酸(分析纯)购自国药化学试剂有限公司;4%多聚甲醛固定液和脱脂奶粉购自武汉Servicebio有限公司;AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(货号:AP-GX-50)购自美国 Axygen 公司 ;QIAamp DNA Stool Mini Kit(货号 :51604)购自QIAGEN公司。甘油三酯(TG;货号:A110-1-1)、总胆固醇(T-CHO;货号:A111-1-1)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C;货号:A112-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C;货号:A113-1-1)购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 小鼠与饮食 所有C57BL6J雄性小鼠(15周龄)均购自南京大学模型动物研究中心。实验开始前饲养1周,单笼饲养,室温(20±2)℃,相对湿度(50±10)%,光照周期为 12 h,自由饮食饮水。32只小鼠随机分为4组:正常饮食组(ND,n=8),高脂饮食组(HFD,n=8),单宁酸正常饮食组(ND+TA,n=8),单宁酸高脂饮食组(HFD+TA,n=8)。每日上午10点给小鼠进行灌胃,单宁酸正常饮食组(ND+TA)和单宁酸高脂饮食组(HFD+TA)以400 mg/kg BW的剂量灌胃单宁酸溶液(40 g/L),灌胃溶液体积为0.1 mL/10 g BW,正常对照组和肥胖对照组按0.1 mL/10 g BW的剂量灌胃生理盐水。每天定时对小鼠体重和摄食量进行称量。4组动物均连续灌胃 9 d,试验结束时收集新鲜粪便于-80℃条件下保存,用于后续分析测定。于小鼠处死前一晚,撤去小鼠饲料,更换垫料,禁食不禁水。12 h后,采取小鼠尾尖采血法,利用罗氏微型血糖仪(Accu-Chek Softclix)检测血糖值,记为空腹血糖。采取摘眼球法取血,4℃静置过夜,1 684×g 离心10 min,所得上清分装保存于-80℃冰箱。小鼠颈椎脱臼处死后并将其解剖,记录各个脏器组织的重量。将所取组织经液氮速冻后,储存于-80℃冰箱。本实验通过武汉科技大学生命科学与健康学院科学伦理委员会批准(20190000206)。

1.2.2 血脂相关指标检测 利用酶标仪测量吸光度,计算出小鼠空腹血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。

1.2.3 结肠组织学分析 取新鲜附睾脂肪和结肠组织1 cm左右于预冷的4%多聚甲醛中固定24 h后,进行脱水,石蜡包埋切片,片厚4 μm。再将切片脱蜡至水,苏木素染细胞核,伊红染细胞质,最后脱水封片。

1.2.4 RT-qPCR 用Trizol试剂提取组织样本总RNA,用逆转录试剂盒合成cDNA,用SYBR荧光染料进行荧光定量PCR。PCR反应体系为20 μL,包括 10 μL SYBR 荧光染料,2 μL 引物(10 μmol/L),1 μL cDNA,7 μL ddH2O。PCR 反应条件为:预变性,95℃,3 min;95℃变性,10 s;退火,56℃,30 s;延长,72℃,30 s,共40个循环。2-ΔΔCt相对定量分析的方法。所有用于RT-qPCR的引物均列于表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers’ sequences for RT-qPCR

1.2.5 16 S rRNA测序分析 称取粪便样品 200 mg,根据QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒说明书进行总 DNA 抽提,用 515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和 926R 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′引物对V4-V5可变区进行 PCR 扩增。采用Usearch(Vsesion 7.0)软件对优化后的序列进行OTU聚类分析。利用Mothur(version v.1.30.1)软件计算Alpha多样性,反映物种多样性和丰度。采用R语言计算PCA、PCoA和NMDS来反映各组样品之间的差异和距离。使用R语言工具分别在门水平和属水平分析各组不同水平的肠道菌群组成。

1.2.6 统计学分析 所有数据统计学分析采用Excel进行,多组之间差异分析采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为基准代表具有统计学差异。数据结果在GraphPad Prism 6.0软件中按照Mean SEM作图。

2 结果

2.1 口服高浓度单宁酸使体重快速降低

正常15周C57BL/6J小鼠和肥胖模型小鼠灌胃高剂量(400 mg/kg BW)单宁酸溶液,对照组灌胃等量生理盐水。高剂量单宁酸干预9 d后,每组选取8只小鼠进行实验分析。体重变化如图所示,高剂量单宁酸可显著降低普通小鼠及肥胖小鼠的体重,正常小鼠体重下降(3.57±0.47)g,肥胖小鼠体重下降(2.32±0.81)g(图1-A,B)。与对照组相比,高剂量单宁酸显著降低了正常小鼠和肥胖模型小鼠的进食量(图1-C)。但是小鼠体内脂肪质量并没有显著改变(图1-D),脂滴面积明显减少(图2-A,B)。高剂量单宁酸短期干预后各项血糖血脂检测指标无显著变化(结果未附)。结果表明,小鼠体重的减轻与食物摄入量降低可能有直接关系。

图1 高剂量单宁酸对小鼠体重的影响Fig.1 Effects of high-dose tannic acid on the body weights of the mice

图2 高剂量单宁酸对小鼠体脂的影响Fig.2 Effects of high-dose tannic acid on the body fats of the mice

2.2 高剂量单宁酸对肠道结构的影响

如图3-A所示,与正常小鼠相比,长期高脂饮食导致小鼠小肠、回肠和结肠质量显著降低(P<0.05),高剂量单宁酸干预9 d后小鼠肠道质量无显著变化。与对照组相比,口服高剂量单宁组小肠和盲肠内容物含量有所增加,但差异不显著,结肠内容物含量显著增加(P<0.05)(图3-B)。结肠组织组织学分析显示(图3-C-E),ND组小鼠结肠组织有黏膜腺体排列,有完整的隐窝和表面上皮。HFD组小鼠肠黏膜和黏膜下层均有轻微炎症细胞浸润,黏膜腺体未对齐,杯状细胞数量和隐窝深度均有显著变化(P<0.01)。与ND组相比,高剂量补充单宁酸后,ND+TA组结肠组织黏膜层隐窝长度明显缩短,杯状细胞受损2/3。与HFD组相比,HFD+TA小鼠结肠黏膜和结肠上皮层炎症细胞浸润较多,隐窝长度缩短至原来的1/2。组织损伤评分见图3-F,结肠组织学分析显示,口服高剂量单宁酸加重了高脂饮食小鼠结肠损伤的严重程度,降低了结肠隐窝长度,减少了杯状细胞数量,并伴有一定程度的炎症浸润。

图3 高剂量单宁酸对肠道结构的影响Fig.3 Effects of high-dose tannic acid on the intestinal structure

2.3 高剂量单宁酸对肠道屏障的影响

肠内容物与肠上皮之间的肠黏膜屏障具有润滑和化学屏障的双重作用,而杯状细胞数量的减少提示高剂量单宁酸可能会影响肠黏液的分泌。Muc2是肠道黏液的主要分泌物,通过RT-qPCR对肠道内Muc2的相对表达量进行检测,结果发现,和各自的对照组ND组和HFD组相比,ND+TA和HFD+TA组Muc2 mRNA表达量显著降低(P<0.01)(图4-A),说明高剂量单宁酸降低了肠黏液Muc2的分泌。

肠黏膜屏障以紧密连接蛋白最为重要,它与多种肠道疾病的发生、发展以及全身缺血缺氧后出现肠损伤、肠黏膜屏障功能受损等有着密切关系。对紧密连接蛋白进行检测发现,高脂饮食轻微下调屏障功能相关基因ZO-1、Occlucin及Claudin的相对表达量,但无显著影响。而高浓度的单宁酸干预后,小鼠结肠中ZO-1、Occlucin及Claudin mRNA表达均显著下降(图4-B),说明高浓度的单宁酸对正常或肥胖小鼠都有破坏肠道屏障的作用。这些结果表明,高剂量单宁酸破坏了肠紧密连接蛋白,导致肠黏膜屏障功能受损。

图4 高剂量单宁酸对肠道屏障的影响Fig.4 Effect of high dose tannic acid on the intestinal barrier

2.4 高剂量单宁酸对小鼠肠道微生物多样性的影响

为了研究高剂量单宁酸对小鼠肠道微生物多样性的影响,本研究通过16S rRNA测序分析比较了小鼠肠道菌群组成的差异。Alpha多样性包括chao指数、ace指数、Shannon指数、Simpson指数、PD_whole_tree指数等,反映了物种丰富度和多样性。由图5-A可知,与ND组相比,HFD组的Sobs指数和ace指数均显著升高(P<0.05),提示长期高脂饲料可能会增加肠道菌群的丰富度;ND+TA组Sobs指数、chao指数、ace指数均显著高于ND组(P<0.001),HFD+TA组显著低于HFD组(P<0.001)。结果显示,正常小鼠高剂量单宁酸的物种丰富度显著增加,肥胖小鼠高剂量单宁酸的物种丰富度显著降低。各组Shannon指数和Simpson多样性指数均不显著。与ND组相比,HFD组的PD_whole_tree指数显著升高(P<0.05);ND+TA 组的PD_whole_tree指数显著高于 ND组(P<0.001),HFD+TA组 的 PD_whole_tree指数显著低于HFD组(P<0.05)。说明口服高剂量单宁酸后,小鼠体内微生物多样性发生了变化。

为了确定不同处理组之间的相似性,采用加权UniFrac距离(β-diversity的代表标志)的主坐标分析(PCA、PCoA和NMDS)图。如图5-B所示,正常饲料组和高脂饲料组的微生物组成不同,ND和ND+TA的微生物组成相似,HFD和HFD+TA的微生物组成也相似。结果表明,高剂量单宁酸没有明显改变小鼠原有的肠道微生物组成。利用维恩图可以计算出多个样本中共同和唯一的OTU的数量,直观的显示出多个样本之间群落组成的相似度和重叠度。4组共取217份,ND组独有的OTU数为17个,ND+TA组独有的OTU数为42个,ND+TA组与ND组共有311个,HFD组唯一的OTU数只有3个独立的OTU,HFD+TA组与HFD组共有311个OTU(图5-C)。门水平热图(图5-D)表明,高剂量单宁酸对小鼠肠道微生物多样性有显著影响。

图5 高剂量单宁酸对肥胖小鼠肠道微生物多样性的影响Fig.5 Effects of high dose tannic acid on the intestinal microbial diversity of the obese mice

2.5 高剂量单宁酸对肥胖小鼠肠道微生物结构的影响

从图6可以看出,与ND相比,HFD组拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著降低(P<0.001),厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)显著升高(P<0.01、P<0.001),厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著升高(P<0.05),提示肥胖小鼠肠道紊乱。高剂量单宁酸干预后,和ND组相比,拟杆菌门的比例在ND+TA组中降低了12%,厚壁菌门的比例在ND+TA组中增加了11%;和HFD组相比,拟杆菌门的比例在HFD+TA组中增加了3%,厚壁菌门的比例在HFD+TA组中减少了4%,但是这些趋势均无显著性差异。在属的水平上(图7),和ND组比较,普通饮食组中单宁酸的添加增加了Alistipes和Ruminococcus的含量。和HFD组相比,高脂饮食组中单宁酸的添加增加了Blautia Oscillibacter和Lachnoclostridium的含量,降低了Anaerotruncus的含量。

图6 在门水平上的物种组成成分及组间差异分析Fig.6 Analysis of species composition and inter-group differences at the phylum level

图7 在属水平上的物种组成成分及组间差异分析Fig.7 Analysis of species composition and inter-group differences at the genus level

3 讨论

高剂量单宁酸的干预使普通小鼠及肥胖小鼠的体重和进食量显著降低,脂滴面积明显减少,但是小鼠体内脂肪质量并没有显著改变,各项血糖血脂检测指标无显著变化。这些结果表明,小鼠体重的减轻可能与食物摄入量降低有直接关系,这与单宁酸所具有的抗营养特性相关。另一方面,研究发现在饲料中添加一定剂量的单宁酸可以防止仔猪腹泻、促进仔猪生长[19]。并且单宁酸可以提高营养物质利用率、促进肉鸡体重的增长[20]。这些研究表明单宁酸对体重具有双向调节作用。在饲料中添加合适的剂量单宁酸可以促进体重增长,这可能与单宁酸的收敛作用减缓了肠道蠕动使得营养物质得到更好的消化吸收有关。但是高剂量单宁酸则会起到降低体重的作用,这可能是与单宁酸所造成的食物摄入量降低相关。

高剂量单宁酸干预后小鼠各段肠道内容物含量的增加说明高剂量单宁酸的干预使小鼠体内的消化吸收受到抑制,进而影响到小鼠的食欲,使食物摄入量降低。进一步结肠组织学分析显示,口服高剂量单宁酸降低了结肠隐窝长度,而结肠隐窝长度的减少表明肠道表面积的减少,不利于肠道吸收[21],与上述结果中小鼠体内各肠段中内容物含量的增加相一致。杯状细胞是位于黏膜柱状上皮细胞之间的黏液分泌细胞,可以合成和分泌黏液蛋白,与消化道内的水、无机盐、抗菌肽共同形成黏液屏障[22-23]。本研究中,口服高剂量单宁酸减少了杯状细胞数量,提示高水平单宁酸可能会降低肠道黏液的分泌。Muc2是肠道黏液的主要分泌物,Muc2表达量的变化会影响肠道通透性及肠黏膜免疫功能,进而影响肠黏膜屏障[24]。而肠黏膜屏障以紧密连接蛋白最为重要,它与多种肠道疾病的发生、发展以及全身缺血缺氧后出现肠损伤、肠黏膜屏障功能受损等有着密切关系。通过RT-qPCR对肠黏液MUC2和紧密连接蛋白进行检测发现,高剂量单宁酸降低了肠黏液MUC2的分泌和小鼠结肠中紧密连接蛋白ZO-1、Occlucin及Claudin mRNA表达水平。这些结果表明,高剂量单宁酸破坏肠道紧密连接蛋白,导致肠黏膜屏障功能受损,这在一定程度上影响了小鼠对食物的消化吸收。因此可以推测小鼠肠道屏障功能的破坏可能是高剂量单宁酸干预后小鼠体重快速下降的主要潜在原因。

此外,高剂量单宁酸明显改变了小鼠肠道微生物的物种丰富度和多样性。高剂量单宁酸干预正常小鼠会使其肠道菌群物种丰富度显著增加,而干预肥胖小鼠则会使其肠道菌群物种丰富度显著降低。高剂量单宁酸干预后,小鼠体内微生物多样性发生了变化,但是高剂量单宁酸没有明显改变小鼠原有的肠道微生物组成。在门的水平上,厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是门中比较典型的两种细菌,其比例的增加是肠道失调的标志[25]。高剂量单宁酸虽然可以在一定程度上改变肠道菌群的组成,但是因为干预时间不够久,这些改变并无显著性差异。并且高脂组中肠道菌群的改变趋势低于普通饲料组,说明高脂饲料可能会影响到单宁酸对肠道菌群的影响。在属的水平上,单宁酸的添加可以促进SCFAs菌Alistipes、Ruminococcus和Blautia的生成,可以起到预防炎症,维持肠道稳态的作用[26-27]。说明单宁酸的添加可能会对机体的肠道微生物组成起到正向的调节作用。据报道,Alistipes和Oscillibacter菌在发生肥胖的时候会显著减少[28],说明这两种菌与肥胖的发生呈负相关。单宁酸的添加增加了这两种肥胖相关菌群Alistipes和Oscillibacter的含量,因此,可以推测本研究中单宁酸造成的体重降低可能与肠道菌群的变化有一定的相关性。目前尚不清楚所观察到的肠道微生物群变化是对单宁酸变化的直接反应,还是通过黏膜免疫反应的变化间接介导的。虽然本研究结果表明,单宁酸、结肠损伤和粪便微生物群变化之间存在联系,但仍需要进一步探索不同剂量单宁酸对肠道屏障和肠道菌群的影响,以更好地了解单宁酸毒性作用。

4 结论

高剂量单宁酸干预可显著降低普通小鼠及肥胖小鼠的体重和进食量,并且使小鼠各肠段内容物含量有所增加,其中结肠内容物含量得到显著增加。高剂量单宁酸干预加重了高脂饮食小鼠结肠损伤的严重程度,破坏了肠紧密连接蛋白,导致肠黏膜屏障功能受损。此外,高剂量单宁酸明显改变了小鼠肠道微生物的物种丰富度和多样性,并且可以促进SCFAs产生菌Alistipes、Ruminococcus和Blautia以及肥胖负相关菌群Alistipes和Oscillibacter的含量增多。

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