逍遥散对慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠学习记忆能力及NGF、p75NTR表达的影响❋

张 铮， 洪妙莹， 蓝敏敏， 陈 嫒， 郑于林， 肖华业△， 李晓红,2△

(1.广西中医药大学， 南宁 530200；2.广西中医药大学广西中医基础研究重点实验室， 南宁 530200)

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，由柴胡、当归、白术、白芍、茯苓、甘草、烧生姜、薄荷等8味药物组成，具有疏肝解郁、养血健脾之功效。逍遥散在宋代主要用于妇科，现已被广泛应用于妇科、内科、外科、儿科、皮肤科等临床各科疾病，是治疗肝郁脾虚证的经典名方，也是抗应激损伤的经典方剂之一。肝郁脾虚证是指肝失疏泄、脾失健运所致的中医证候。情志异常是肝郁脾虚证的主要诱因，现今社会生活节奏快，竞争激烈，各方面的压力不断增加，再加上起居不规律等因素均可引起人们心理负荷加重，易导致情志抑郁、肝气不舒，使得肝郁脾虚证成为临床的常见证候。

慢性应激病理生理过程与中医情志疾病证候形成过程相似[1]。目前肝郁脾虚证动物模型常采用情志刺激造模，慢性束缚应激是常用造模方法之一[2]。研究表明, 大鼠接受第21天慢性束缚应激模拟从肝郁到脾虚的演变过程, 束缚应激第7天 符合“肝郁证”表现，束缚应激第21天符合“肝郁脾虚证”表现[3，4]。对海马基因表达谱的研究则发现，大鼠束缚应激第7天，海马组织显著激活“对刺激的反应”这一生物过程的功能，而束缚应激的第21天，海马组织基因调控网络显示出“海马神经元凋亡与增生平衡紊乱，神经元凋亡加速，生长受到抑制”[5]。这些研究从宏观表征观察和微观指标检测分析均提示，束缚应激第7天的大鼠对应激反应增强，束缚应激第21天由于应激时间较长，大鼠进一步耗尽机体贮存的能量，对应激的抗拒减少，对应激的反应减退。在前期多项研究结果显示，第21天慢性束缚应激大鼠存在抑郁、焦虑、学习记忆功能减退等表现，并部分揭示出可能的发病机制，而逍遥散对应激大鼠的上述症状表现均具有明显的改善作用[4,6-9]。为进一步探寻其发生机制及逍遥散的作用机理，本研究通过慢性束缚应激方法制作肝郁脾虚证大鼠模型，动态观察了应激大鼠血清神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、神经营养因子受体p75NTR(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)的含量变化及海马和下丘脑组织中NGF、p75NTR的基因表达变化及逍遥散的调节作用。本研究通过广西中医药大学动物伦理委员会批准(批号DW20190111-009)。

1 材料

1.1 动物

SD雄性大鼠50只，体质量(200±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号SCXK(桂)2009-0002。大鼠饲养于广西中医药大学动物实验中心普通级动物房，常规喂饲饲料及饮用水，室温20～22 ℃，相对湿度50%～60%，光照节律 12 L∶12 D(7∶00 ～19∶00)。

1.2 药物

实验所用中药复方逍遥散选自《太平惠民和剂局方》，药物购自广西中医药大学附属瑞康医院。药物组成：柴胡30 g、白芍30 g、当归30 g、茯苓30 g、白术30 g，炙甘草15 g，薄荷10 g(后下)，烧生姜10 g，用水煎成汤剂，浓缩至含生药量1.67 g/mL。

1.3 主要试剂与仪器

Trizol试剂盒(货号15596026)，美国Ambion公司；逆转录试剂盒(货号639505)，TAKARA公司；YBR Green PCR 试剂盒(货号KM4101)，KAPA Biosystems公司；Rat NGF、p75NTR ELISA试剂盒(货号JYM0643Ra、JYM1161Ra)，基因美公司。

PCR仪(型号GE48527)，杭州柏恒科技有限公司；荧光定量PCR仪(型号CFX-Connect 96)，美国Bio-Rad公司；酶标仪(型号DNM-9602)，北京普朗新技术有限公司；BW-MWM101水迷宫(直径150 cm、高70 cm，平台直径15 cm、高40 cm)，上海软隆科技发展有限公司；ANY-MAZE动物行为学分析系统(版本号4.99 m)，美国Stoelting。

2 方法

2.1 分组与模型制备

将50只雄性SD大鼠适应性饲养5 d后，采用随机数字表法分为正常对照组、第7天模型组、第7天逍遥散组、第21天模型组、第21天逍遥散组每组各10只。采用慢性束缚应激方法造模[9]，除正常组以外的各组大鼠均用束缚架进行捆绑束缚，每日于18∶00～6∶00点间随机束缚3 h，第7天模型组和第7天逍遥散组捆绑束缚7 d，第21天模型组和第21天逍遥散组捆绑束缚21 d；从造模第1天开始每日在捆绑前1 h给各组大鼠灌胃，逍遥散组大鼠灌服逍遥散中药煎液，根据成人逍遥散每日用量，按体表面积换算成大鼠用药量为16. 7 g/(kg·d)，灌胃容积为1 mL/100 g体质量，每日1次，连续7 d和21 d；正常组、模型组大鼠每日灌服同等换算量的0.9%氯化钠溶液，造模期间根据大鼠体质量调整给药量。

2.2 Morris水迷宫实验

水迷宫实验是通过观察实验动物学习寻找隐藏在水中平台的方法来测试其对空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力。水迷宫分4个象限，在第3象限设一平台，记录大鼠在 60 s 内找到平台的时间，实验分为训练期和去平台期。训练期将各组大鼠按第1、2、3、4象限的顺序依次放入水中，大鼠在60 s内能寻找到平台则记录其登上平台所需要的时间。若大鼠在60 s内未能找到平台则由实验者用手将其引导至平台，时间记为60 s，随后让其在平台上停留30 s，以根据4个象限的参照物进行空间学习和记忆。每天每只大鼠训练4次共4 d，每只大鼠总计训练16次。去平台期撤除水中平台，以原平台对角象限为入水点，将大鼠面朝池壁置入水中游泳60 s，记录大鼠首次穿过原平台区域的时间，若60 s内未穿过记为60 s。本实验在训练期对大鼠共进行16次训练，造模期间不再进行任何训练，在造模的第0、7、21天分别对大鼠进行去平台观察，并记录大鼠首次穿过原平台区域的时间。

2.3 取材

造模第7天和第21天结束且各组大鼠水迷宫实验测试完毕后处死大鼠取材。10%水合氯醛腹腔注射，深度麻醉后断头取脑、取血，冰上剥离下丘脑和海马组织，-80 ℃保存，用于荧光定量PCR实验。

2.4 大鼠血清NGF、p75NTR含量测定

采用ELISA法检测血清NGF、p75NTR含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.5 荧光定量PCR检测下丘脑、海马组织NGF、p75NTR 的mRNA表达

Trizol 法从下丘脑、海马组织中提取总RNA，微量核酸蛋白分析仪检测RNA浓度、纯度及完整性，将 RNA反转录合成cDNA，采用20 μL反应体系行PCR扩增，所有操作均按试剂盒说明书进行。PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。GAPDH上游：5′-CAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游：5′-CCAGTAGACTCCACGACAT-3′，产物长度138bp；NGF上游：5′-ACCCGCAACATCACTG-3′，下游：5′-TCTTATCTCCAACCCACA-3′，产物长度241bp；p75NTR上游：5′-ACGACCAGCAGACCCAT-3′，下游：5′-TTTCTCTACCTCCTCACGC-3′，产物长度104bp。采用2-△△Ct计算NGF、p75NTR 的mRNA相对表达量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠水迷宫实验首次进入平台区域时间

表1示，各组大鼠第0天首次进入平台区域时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。第7天各组大鼠进入平台区域时间均较第0天下降，其中以第7天和第21天模型组下降最为明显，但与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；第7天逍遥散组与第7天模型组及第21天逍遥散组与第21天模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较，第21天模型组大鼠首次进入平台区域时间显著增加(P<0.01)；与第21天模型组比较，第21天逍遥散组首次进入平台区域时间显著下降(P<0.01)。

表1 各组大鼠水迷宫首次进入平台区域时间比较

3.2 各组大鼠血清NGF、p75NTR含量

表2示，与正常组比较，第7天模型组大鼠血清NGF、p75NTR含量均显著增加(P<0.01)，第21天模型组大鼠血清NGF含量显著下降，p75NTR含量显著增加(P<0.05，P<0.01)。与第7天模型组比较，第7天逍遥散组血清NGF、p75NTR含量均显著下降(P<0.01)；与第21天模型组比较，第21天逍遥散组血清NGF含量显著上升，p75NTR含量显著下降(P<0.05，P<0.01)。

3.3 各组大鼠下丘脑、海马组织NGF、p75NTR mRNA表达比较

表3、4示，与正常组比较，第7天模型组大鼠下丘脑和海马组织NGF、p75NTR的 mRNA表达均显著增加(P<0.01)，第21天模型组大鼠下丘脑和海马组织NGF的 mRNA表达均显著下降，下丘脑p75NTR mRNA表达显著下降，海马p75NTR mRNA表达显著增加(P<0.05，P<0.01)。与第7天模型组比较，第7天逍遥散组下丘脑和海马组织NGF、p75NTR mRNA表达均显著下降(P<0.01)；与第21天模型组比较，第21天逍遥散组下丘脑、海马NGF和下丘脑p75NTR 的mRNA表达均显著上升，海马p75NTR 的mRNA表达显著下降(P<0.05，P<0.01)。

表2 各组大鼠血清NGF、p75NTR含量比较

表3 各组大鼠下丘脑组织NGF、p75NTR mRNA表达比较

表4 各组大鼠海马组织NGF、p75NTR mRNA表达比较

4 讨论

应激是机体受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反应。海马是学习、记忆以及与认知、情感有关的关键性脑区，下丘脑是情绪表达系统中的重要组成部分，是调节内脏活动和内分泌活动的高级神经中枢，海马与下丘脑都是介导应激反应最重要的脑区之一。NGF是神经营养因子家族中第一个被发现也是到目前为止研究得最清楚的一个神经营养因子，在神经元的存活、发育和维稳、轴突的生长、突触的形成以及损伤神经的再生修复等方面发挥着关键作用，被视为认知障碍的治疗靶点[10，11]。如Wang等[12]发现，胚胎期缺乏NGF会增加小鼠神经节中神经细胞的凋亡。 Song 等[13]研究发现，NGF的表达增加可能有助于在急性脑损伤和中风早期观察到神经炎症诱导的神经保护作用。 赵军等[14]的研究表明，海马NGF的表达增加可改善1型糖尿病大鼠的学习记忆能力。NGF主要通过与2种不同类型受体相结合而发挥作用，一种是高亲和力的酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase receptor A，TrkA)，另一种是低亲和力的神经营养因子受体p75NTR。TrkA与p75NTR均为跨膜蛋白受体，参与调节以神经元为主的某些细胞的生长、分化、存活、凋亡以及修复等多种生物学效应。TrkA是NGF的功能受体，一般介导正向信号传导作用，如促进神经元生长并维持其存活；p75NTR为肿瘤坏死因子超家族成员之一，能与所有类型的NGF相结合，具有多向性功能，介导正向和反向信号2种效应，除可促进神经元存活生长外，还可抑制神经元轴突生长并诱导神经元凋亡。p75NTR 可协助TrkA 受体发挥功能，当 p75NTR和TrkA 同时存在时，p75NTR 可增加TrkA 与NGF 的亲和力，同时还能加快TrkA与NGF的结合速率[15]，从而发挥促进神经生长与存活的作用；当TrkA缺如时，NGF与p75NTR的结合则会介导细胞的凋亡[16]，同时p75NTR可与sortilin受体形成复合物，以更高的亲和力与proNGF相结合，以诱导凋亡信号通路的激活[17]。

本实验结果表明，大鼠应激第7天后，NGF、p75NTR在下丘脑和海马组织中的mRNA表达及血清中的含量均显著增加，而应激第21天后，NGF在下丘脑和海马组织中的mRNA表达及血清中的含量均出现显著降低，p75NTR在血清中的含量和海马中的mRNA表达仍然显著升高，在下丘脑中的mRNA表达则显著降低。水迷宫实验显示，在第7天应激时大鼠出现了记忆能力的增强，第21天则学习记忆能力减退。本次研究结果与Aloe、BS、汪洋等结果一致。Aloe等[18]的研究发现，新兵首次跳伞后血清NGF水平增加了107%，同时跳伞应激还增强了外周血单个核细胞中p75NTR和TrkA受体的分布。BS等[19]发现，在急性而非慢性强光旷场应激中，成年和老年大鼠海马CA1和CA3区NGF细胞密度增加。汪洋等[20]的研究发现，抑郁症患者血清NGF含量降低。至于慢性应激影响大鼠的学习记忆，以往已有大量的文献报道，因此结合文献报道和前期研究，推断大鼠应激第7天时，NGF水平在海马和下丘脑出现的显著上升为保护性上升，其目的可能是在急性应激状态下增加神经元突触的发生，以确保机体在面对应激时具有较强的抵抗力；而p75NTR显著上升则可能有助于TrkA与NGF相结合，加快其结合速率，为机体抵抗应激做准备。大鼠应激第21天后，NGF在海马和下丘脑显著下降，提示应激大鼠海马与下丘脑的神经元密度可能较正常大鼠减少；而海马p75NTR在NGF下降的情况下显著上升，可能更加速了海马神经元的凋亡与海马功能的损害；而下丘脑p75NTR与NGF的同步下调，可能减弱了Trk与NGF的结合速率，因此维持下丘脑神经元的活性必定受到影响，更进一步导致下丘脑功能受损。长期的临床和实验研究表明，逍遥散对肝郁脾虚证及应激性疾病具有很好的疗效[21-23]，本实验中逍遥散也表现出良好的作用，能明显提高应激大鼠的学习记忆能力，逆转应激大鼠海马、下丘脑和血清中NGF、p75NTR的异常表达，使其趋于正常水平。

综上所述，第21天慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠下丘脑、海马组织NGF、p75NTR的表达异常，可能是应激大鼠出现学习记忆功能减退、焦虑、抑郁的机制之一，而调节NGF、p75NTR的异常表达亦可能是逍遥散改善应激大鼠学习记忆和焦虑、抑郁的机制之一，但其具体机制均有待于进一步的研究。此外研究表明，NGF和p75NTR 在神经系统之外也发挥着重要作用，如调控炎症反应、免疫应答、肿瘤的发生与转移等。前期的研究也发现，慢性束缚应激大鼠出现炎症反应、免疫功能失调、多条与肿瘤相关的通路被激活等表现，那么应激大鼠体内NGF和p75NTR的表达异常是否也参与了这些病理机制，亦有待于今后更深入的研究。