江西铅山红芽芋抗病蛋白基因克隆和表达分析

洪森荣 邓雨晴 张玲 张妮 张雯齐 张新语 赵若雅 郑潘鸯 郑紫娟 周融冰

摘要：对江西铅山红芽芋抗病蛋白基因进行克隆和表达分析，以期为解析江西铅山红芽芋的抗病机制奠定基础，同时为江西铅山红芽芋的遗传改良提供候选基因。通过江西铅山红芽芋试管苗转录组数据库筛选到江西铅山红芽芋抗病蛋白基因的核心片段，利用RT-PCR技术克隆江西铅山红芽芋抗病蛋白基因，并用生物信息学方法和实时定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果表明，江西铅山红芽芋抗病蛋白基因cDNA总长度为264 bp，G+C含量为46.59%;江西铅山红芽芋抗病蛋白由88个氨基酸组成，分子量为10 116.53 u，等电点为6.42，为亲水性蛋白;二级结构由α-螺旋（23.68%）、β-片层（14.77%）、无规则卷曲（61.36%）构成;三级结构为单体;江西铅山红芽芋抗病蛋白主要存在于叶绿体和细胞核中;江西铅山红芽芋抗病蛋白在进化上与芋（Colocasia esculenta）的亲缘关系较近，尤其是与芋的hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在进化上具有最高的亲缘关系。实时定量PCR结果显示，抗病蛋白基因在江西铅山红芽芋中的表达存在器官特异性，在叶片和球茎膨大初期的表达量最高。综合分析可知，江西铅山红芽芋抗病蛋白具有典型的抗病蛋白结构，在进化上高度保守。

关键词：江西铅山红芽芋;抗病蛋白;基因克隆;表达分析

中图分类号： S632.301  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）09-0021-06

江西铅山红芽芋（Colocasia esculenta L. Schoot var. cormosus‘Hongyayu）是江西省知名名优特农产品和国家地理标志农产品[1]，属天南星科本草植物，药食兼优[2-3]。自然界的各种微生物会对植物的生长发育造成一定的威胁，在与病原菌的长期共进化过程中，植物为免受病原微生物侵害形成了一套保护自身的免疫应答调控机制[4]。病原微生物分泌的效应蛋白可被抗病蛋白特异识别，从而触发免疫响应，产生或激活能够特异识别效应因子的抗性蛋白，从而减少病原微生物对植物的侵扰[5]。抗病蛋白可分为跨膜受体蛋白、蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、毒素还原酶、核苷酸结合富含亮氨酸重复序列（nucleotide binding-leucine rich repeat，NB-LRR）抗病蛋白等5种;目前克隆到的抗病蛋白编码基因大多属于NB-LRR类，同属于NB-LRR类抗病蛋白对应的编码基因还有TNL（TIR-NB-LRR）和CNL（CC-NB-LRR）2类[6]。因此，克隆江西铅山红芽芋抗病蛋白编码基因并检测其组织表达特异性，对了解江西铅山红芽芋抗病品种选育具有重要意义。目前关于抗病蛋白（disease resistance protein）编码基因的研究尚少见。Pit是一种对稻瘟病具有抗性的NLR蛋白，水稻GTPase OsRac1直接与Pit相互作用，Pit的活性形式诱导了质膜上OsRac1的激活，OsRac1参与了Pit介导的活性氧（ROS）产生和过敏反应（HR）过程，是水稻Pit介导的抗病性所必需的[7]。烟草花叶病毒抗性N基因是烟草花叶病毒复制酶中识别解旋酶结构域的Toll白细胞介素受体（TIR）-NBS-LRR类植物抗病基因的成员，N蛋白在诱导子的作用下发生寡聚，但P-环基序突变可消除寡聚作用。RNBS-A基序和TIR结构域的功能缺失突变保留了寡聚的能力，寡聚是N介导抗烟草花叶病毒（TMV）的一个早期事件[8]。植物免疫系统对病原菌的识别受抗病基因结构相关的多态产物控制。RAR1和/或SGT1b介导许多R蛋白的功能，RAR1通过一种未知的机制控制前激活R蛋白的积累;拟南芥SGT1b在植物免疫系统中具有2种不同的、在遗传上可分离的功能：SGT1b拮抗RAR1，在感染前负调控R蛋白的积累;SGT1b具有RAR1独立的功能，在感染过程中能够调节细胞的程序性死亡;RAR1和SGT1的平衡活性与胞浆HSP90共同调节活化前R蛋白的积累和信号传导能力[9]。拟南芥NPR1蛋白是调节水杨酸依赖性基因表达的关键蛋白，NPR1与基本结构域/亮氨酸（Leu）拉链转录因子TGACG基序结合因子（TGA）类成员有差异的相互作用，并调节其DNA的结合活性。TGA1基因中Cys-260和 Cys-266 的定点突变使其能与酵母、拟南芥中的NPR1相互作用，TGA1依赖于Cys残基的氧化状态来介导与NPR1的相互作用。TGA1的分子内二硫键包括与NPR1的相互作用，NPR1只能刺激TGA1还原态的DNA结合活性。与动物、酵母不同，TGA1的DNA结合活性不受氧化还原作用调节[10]。目前，对红芽芋的研究主要集中在脱毒快繁[1]、微芋诱导[2]、下游加工[3]、成分分析[11]等方面，关于红芽芋抗病蛋白方面的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆江西铅山红芽芋抗病蛋白基因，并用生物信息学方法和实时定量PCR方法进行序列分析和组织表达分析，为揭示江西铅山红芽芋抗病蛋白的生物学功能提供理论依据，为从分子水平选育江西铅山红芽芋抗病品种提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

江西铅山紅芽芋试管苗。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 用TRIzol试剂提取江西铅山红芽芋试管苗的总RNA，提取步骤参照说明书，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和完整性。以提取获得的RNA为模版，按照M-MLV cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。逆转录引物采用Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具体步骤参考说明书。179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

1.2.2 抗病蛋白基因的克隆 根据转录组组装的Unigene序列信息（TRINITY_DN15482_c0_g1），用Primer Premier 5.0设计引物（F：5′-CGAGGATACACAGGTTCACGG-3′;R：5′-GAATTCTAACTTCTGGAGTTCTGGG-3′）。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s，54.1 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将PCR产物回收，使pMD19-T载体与条带（含有目的基因）连接，并用热激法转化感受态细胞大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α，提取阳性转化子（鉴定正确）中的质粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 抗病蛋白基因的生物信息学分析 氨基酸序列用BioEdit软件分析，酶的理化性质用ProtParam预测，酶的疏/亲水性用ProtScale预测。使用GOR I软件在线预测酶的二级结构。使用SWISS-MOLD在线预测酶的三级结构。采用WoLF PSORT在线预测基因的表达部位。通过DNAMAN和BioEdit软件进行氨基酸序列比对，利用MEGA 5.0进行系统进化树的构建。

1.2.4 抗病蛋白基因的组织表达分析 分别取500 ng江西铅山红芽芋试管苗根、茎、叶、试管球茎（初期、中期和末期）的RNA，将其反转录为cDNA。荧光定量PCR（qRT-PCR，SYBR Green Ⅰ）检测的内参基因为GAPDH。设计的引物序列如下：F，5′-TGTGTCTCCCTCCAGTGCTCA-3′;R，5′-TTTCTCGCCCCCCCTGTTCA-3′;目标基因片段大小145 bp;变性温度（T m）53.6 ℃。qRT-PCR检测采用 20 μL 反应体系，PCR反应程序：95 ℃ 预变性 10 min;95 ℃ 变性 10 s，60 ℃ 复性34 s，72 ℃延伸 15 s，40个循环。用2-ΔΔC T法计算基因表达水平。试验重复3次，所有数据表示为“平均值±标准差”，并用SPSS 19.0软件进行统计分析，用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验抗病蛋白基因组织表达的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 江西铅山红芽芋抗病蛋白基因的cDNA序列

RT-PCR扩增结果显示，江西铅山红芽芋抗病蛋白基因cDNA总长度为264 bp，G+C含量为46.59%（图1、图2、图3）。

2.2 江西铅山红芽芋抗病蛋白的氨基酸序列

用ProtParam预测的江西铅山红芽芋抗病蛋白的氨基酸序列见图4。江西铅山红芽芋抗病蛋白由88个氨基酸组成，分子量为10 116.53 u，等电点为6.42，为亲水性蛋白。各氨基酸的数目和比例：丙氨酸（Ala，A）（5个，5.7%）、精氨酸（Arg，R）（7个，8.0%）、天冬氨酸（Asp，D）（3个，3.4%）、半胱氨酸（Cys，C）（4个，4.5%）、谷氨酰胺（Gln，Q）（6个，6.8%）、谷氨酸（Glu，E）（7个，8.0%）、甘氨酸（Gly，G）（6个，6.8%）、异亮氨酸（Ile，I）（4个，4.5%）、亮氨酸（Leu，L）（11个，12.5%）、赖氨酸（Lys，K）（3个，3.4%）、苯丙氨酸（Phe，F）（8个，9.1%）、脯氨酸（Pro，P）（3个，3.4%）、丝氨酸（Ser，S）（9个，10.2%）、苏氨酸（Thr，T）（5个，5.7%）、色氨酸（Trp，W）（1个，1.1%）、酪氨酸（Tyr，Y）（4个，4.5%）、缬氨酸（Val，V）（2个，2.3%）。带负电荷氨基酸残基总数（Asp+Glu）为10个，带正电荷氨基酸残基总数（Arg+Lys）为10个。失稳指数（Ⅱ）计算为50.84，表明该蛋白属于不稳定蛋白。

2.3 江西铅山红芽芋抗病蛋白的亲疏水性分析

疏水区域用高峰值区域表示，其数值一般为正值;而亲水区域用低谷区域表示，其数值一般为负值。从图5可以看出，最大疏水值为2.00左右，说明相应位点的疏水性最强;最大亲水值为-2.5左右，说明相应位点的亲水性最强。江西铅山红芽芋抗病蛋白表现出高度亲水性，说明该蛋白为亲水性蛋白。

2.4 江西铅山红芽芋抗病蛋白的二级结构分析

由图6、图7可见江西铅山红芽芋抗病蛋白的二级结构预测结果。GOR预测结果显示，其二级结构由α螺旋（Hh，23.86%）、β-片層（Ee，14.77%）、无规则卷曲（Cc，61.36%）构成。从分布位点上看，C端、N端主要含有α-螺旋、无规则卷曲和β-片层，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋散布于整个蛋白中。

2.5 江西铅山红芽芋抗病蛋白三级结构的分析

SWISS-MODEL预测结果（图8）显示，江西铅山红芽芋抗病蛋白的三级结构为单体，多由 α-螺旋和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致。

2.6 江西铅山红芽芋抗病蛋白的亚细胞定位

用WoLF POSRT在线软件对江西铅山红芽芋抗病蛋白基因的表达部位进行预测，结果显示，定位于叶绿体中的蛋白质数量为9个，定位于细胞核中的蛋白质数量为3个，定位于线粒体中的蛋白质数量为1个，定位于细胞质中的蛋白质数量为1个，表明江西铅山红芽芋抗病蛋白基因主要存在于叶绿体和细胞核中（图9）。

2.7 江西铅山红芽芋抗病蛋白的系统进化分析

由构建的进化树可以看出，江西铅山红芽芋与芋（Colocasia esculenta）在一个大分支下，说明江西铅山红芽芋抗病蛋白在进化上与C. esculenta的亲缘关系较近，尤其是与C. esculenta hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical  peotein Taro_046553（MQM13630.1）在进化上具有较高的亲缘关系（图10）。179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

2.8 江西鉛山红芽芋抗病蛋白同源蛋白的序列比对信息

江西铅山红芽芋抗病蛋白同源蛋白的序列比对信息见图11，其中※号区域是该蛋白家族的保守结构域。氨基酸同源性、保守区域及进化关系显示，芋抗病蛋白家族成员之间的氨基酸序列一致性较高，进一步证实：江西铅山红芽芋抗病蛋白在进化上与C. esculenta的亲缘关系较近，尤其是与C. esculenta hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在进化上具有较高的亲缘关系。

2.9 江西铅山红芽芋不同器官及球茎膨大不同时期抗病蛋白基因的表达分析

由图12可以看出，江西铅山红芽芋抗病蛋白基因在根、茎、叶中及在球茎膨大初期、中期、末期中均有表达，但在根、茎、叶中及球茎不同膨大期中的表达情况差异显著，其中江西铅山红芽芋抗病蛋白基因在叶、球茎膨大初期的表达量最高。

3 结论与讨论

为了应对复杂多变的环境，植物在生长发育过程中构建了不同层级（初级、次级）的免疫反应。初级免疫反应是指宿主细胞膜可以识别病原微生物的相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP），PAMP触发的免疫反应（PAMP triggered immunity，PTI）被激活[12-14]。次级免疫反应是指微生物为了应对植物的初级免疫反应，注入一些毒性因子（即效应因子）到植物细胞内，抑制PAMP触发的免疫反应;为了避免感病，植物进化出抗病蛋白，抗病蛋白可特异性识别效应因子，效应因子触发的免疫反应（effectors triggered immunity，ETI）被激活[15-16]。ETI比PTI更强烈和迅速，引起植物局部的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），导致植物发生超敏反应（hypersensitive response，HR），有效遏制病原菌进一步扩散[17]。本试验利用同源克隆技术成功克隆了江西铅山红芽芋的抗病蛋白基因序列，江西铅山红芽芋抗病蛋白基因的cDNA总长度为264 bp，G+C含量为46.59%;江西铅山红芽芋抗病蛋白由88个氨基酸组成，分子量为10 116.53 u，等电点为6.42，为亲水性蛋白;二级结构由α-螺旋（23.68%）、β-片层（14.77%）、无规则卷曲（61.36%） 构成;三级结构为单体;江西铅山红芽芋抗病蛋白主要存在叶绿体和细胞核中;江西铅山红芽芋抗病蛋白在进化上与芋的亲缘关系较近，尤其是与芋的hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在进化上具有较高的亲缘关系。实时定量PCR结果显示，抗病蛋白基因在江西铅山红芽芋中的表达存在器官特异性，在叶片、球茎膨大初期的表达量最高。由此可见，江西铅山红芽芋抗病蛋白基因的克隆和表达分析，可为解析江西铅山红芽芋的抗病机理奠定基础，同时为江西铅山红芽芋遗传改良提供候选基因。

参考文献：

[1]周庆红，刘星月，王葡萄，等. 脱毒红芽芋不同世代生长特性及产量分析[J]. 种子，2020，39（2）：96-98.

[2]刘星月，朱强龙，李慧英，等. 红芽芋脱毒试管芋诱导及植株再生[J]. 园艺学报，2020，47（12）：2427-2438.

[3]李 云，牛丽亚，涂 瑾，等. 亲水胶体对红芽芋全粉理化特性和消化特性的影响[J]. 中国粮油学报，2020，35（2）：12-17.

[4]房卫平，谢德意，李志芳，等. NBS-LRR类抗病蛋白介导的植物抗病应答分子机制[J]. 分子植物育种，2015，13（2）：469-474.

[5]闫 佳，刘雅琼，侯岁稳. 植物抗病蛋白研究进展[J]. 植物学报，2018，53（2）：250-263.

[6]Bemoux M，Ve T，Williams S，et al. Structural and functional analysis of a plant resistance protein TIR domain reveals interfaces for self-association，signaling，and autoregulation[J]. Cell Host Microbe，2011，9（3）：200-211.

[7]Kawano Y，Akamatsu A，Hayashi K，et al. Activation of a Rac GTPasebytheNLRfamilydiseaseresistanceproteinpitplaysa

critical role in rice innate immunity[J]. Cell Host & Microbe，2010，7（5）：362-375.

[8]Mestre P，Baulcombe D C. Elicitor-mediated oligomerization of the tobacco N disease resistance protein[J]. Plant Cell，2006，18（2）：491-501.

[9]Holt B F，Belkhadir Y，Dangl J L. Antagonistic control of disease resistance protein stability in the plant immune system[J]. Science，2005，309（5736）：929-932.179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

[10] Despres C，Chubak C，Rochon A，et al. The Arabidopsis NPR1 disease resistance protein is a novel cofactor that confers redox regulation of DNA binding activity to the basic domain/leucine zipper transcription factor TGA1[J]. The Plant Cell，2003，15（9）：2181-2191.

[11]姜紹通，程元珍，郑 志，等. 红芽芋营养成分分析及评价[J]. 食品科学，2012，33（11）：269-272.

[12]Monaghan J，Zipfel C. Plant pattern recognition receptor complexes at the plasma membrane[J]. Current Opinion in Plant Biology，2012，15（4）：349-357.

[13]Schwessinger B，Ronald P C. Plant innate immunity：perception of conserved microbial signatures[J]. Annual Review of Plant Biology，2012，63（1）：451-482.

[14]Dangl J L，Horvath D A，Staskawicz B J. Pivoting the plant immune system from dissection to deployment[J]. Science，2013，341（6147）：746-751.

[15]Tsuda K，Katagiri F. Comparing signaling mechanisms engaged in pattern-triggered and effector-triggered immunity[J]. Current Opinion in Plant Biology，2010，13（4）：459-465.

[16]Howden A J M，Huttema E. Effector-triggered post-translational modifications and their role in suppression of plant immunity[J]. Frontiers in Plant Science，2012（3）：160.

[17]Jones J D G，Dangl J L. The plant immune system[J]. Nature，2006，444（7117）：323-329.179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2