白藜芦醇苷对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障的保护作用研究

刘洋，李嘉民，陈荣，张祥建

（1.天津市环湖医院神经内科，天津 300350；2.石家庄市人民医院神经内科，石家庄 050011；3.河北医科大学第二医院神经内科，石家庄 050000）

近年来，脑卒中已是我国位列第一的致死性疾 病，并给我国社会、经济带来了巨大负担[1]。随着血管再通技术的开展，血管开通同时带来了兴奋毒性、炎症、氧化应激等一系列级联反应，所致的血脑屏障破坏和脑水肿的形成是最终脑卒中致残的两个重要因素，与患者的预后息息相关[2]。血脑屏障功能紊乱是存在于许多神经系统疾患的病理特点，在其各个病理变化过程中起关键作用[3]。而紧密连接蛋白又是维持血脑屏障渗透特性的主要结构。许多研究已表明，白藜芦醇苷具有多方面的神经保护作用[4]。而在脑缺血再灌注损伤后血脑屏障渗透性、紧密连接蛋白的保护方面研究还较少。本研究通过应用白藜芦醇苷干预小鼠脑缺血再灌注损伤模型的方法，探究其对损伤后的血脑屏障的保护作用及对紧密连接蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年雄性CD1 小鼠（25～30 g）共102 只，周龄4～6 周（北京维通利华有限公司），恒温19～25℃饲养，12 h 光照/12 h 黑暗，供应纯净水及标准饲料。

1.2 主要试剂、药物及仪器 伊文思蓝（Biotopped公司，中国），兔抗小鼠Claudin-5 抗体（Abcam 公司，英国），兔抗小鼠Occludin 抗体（Abcam 公司，英国），兔抗小鼠ZO-1 抗体（GeneTex 公司，美国），兔抗小鼠GAPDH 抗体（bioworld 公司，美国），荧光标记羊抗兔二抗（Rockland 有限公司，美国），大鼠抗小鼠CD-31 抗体（BD 公司，美国），荧光标记驴抗大鼠488（康为世纪生物工程公司，德国），荧光标记驴抗兔594（康为世纪生物工程公司，德国），白藜芦醇苷（生理盐水配至3 mg/mL、6 mg/mL）（陕西慧科植物开发有限公司，中国），恒温干燥箱（泰斯特仪器有限公司，中国），荧光显微镜（蔡司公司，德国），多功能酶标仪（Bio-Tek 公司，美国）。

1.3 模型的建立及给药方式 参照Longa 法[5]制作小鼠单侧短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型。将小鼠麻醉后仰卧固定，颈正中纵切口，逐层分离颈部各动脉，夹闭颈内动脉，将颈外动脉远端结扎，离断远心端，于颈外动脉剪口，将线栓轻柔插入，经颈内动脉至大脑中动脉起始处，遇阻力感即停止。1 h后取出线栓，结扎颈外动脉残端，逐层缝合。应用多普勒于术中监测大脑中动脉供血区的血流变化，血流随线栓插入下降，拔出线栓后恢复，说明模型成功。假手术组手术步骤与tMCAO 组一致，不插入线栓。

各组将配制好的白藜芦醇苷和溶剂分别于缺血即刻腹腔注射给药。

1.4 实验动物分组 将实验动物随机分成4 组：假手术组（Sham 组，等体积生理盐水，28 只），缺血再灌注组（tMCAO+等体积生理盐水，28 只），白藜芦醇苷低剂量组（tMCAO+白藜芦醇苷30 mg/kg，18 只），白藜芦醇苷高剂量组（tMCAO+白藜芦醇苷60 mg/kg，28 只）。

实验共使用102 只小鼠。其中，行为学评分共4 组，每组18 只，依据行为学评分结果在白藜芦醇苷两个剂量中选择其一（高剂量组）进行下面的实验。该部分小鼠继续完成脑梗死体积测定（n=18，共3 组，每组6 只），脑组织水含量测定（n=18，共3组，每组6 只），伊文思蓝染色（n=18，共3 组，每组6 只）。另外，Western 印迹共3组，每组6 只；免疫荧光检测共3 组，每组4 只。

1.5 行为学评分 应用改良的Longa 评分法在各组造模后24 h 分别进行神经功能缺损评价。评分标准：0 分：提示无神经功能缺损。1 分：轻度神经功能缺损——不能完全伸展前爪。2 分：中度神经功能缺损——向病损侧转圈。3 分：重度神经功能缺损——向病损侧跌倒。4 分：不可自主行走，意识丧失。

1.6 脑梗死体积测定 提取完整脑组织，将嗅球切除后放入模具，连续切出2 mm 厚脑片（共5 片），浸泡于37℃恒温2% TTC 溶液中，孵育10 min 后于4%多聚甲醛中固定24 h，拍照并使用ImageJ 1.47v软件进行图像分析，计算梗死体积百分比：梗死体积百分比（%）={[总梗死体积-（梗死侧半球体积-梗死对侧半球体积）]/梗死对侧半球体积}×100%。

1.7 脑组织水含量测定 取从额极向后第3 mm至7 mm 皮层脑组织，将右侧脑组织锡纸包裹称得梗死侧湿重，同样方式得到梗死对侧湿重。200℃烤箱烘干10 h，称得双侧干重。计算脑组织含水量:（脑组织湿重-脑组织干重）/湿重×100%。

1.8 伊文思蓝染色 造模给药后即刻经腹腔注射2%伊文思蓝（4 mL/kg），24 h 后心脏灌注，取脑测重，应用50%三氯乙酸溶液按1.5 mL/g 脑组织进行组织匀浆。以3 000 r/min 离心20 min，用酶标仪在620 nm 下测定上清液的吸光度。

1.9 Western 印 迹 检 测 皮 层ZO -1、Occludin、Claudin-5 蛋白的表达 提取蛋白后，经上样、电泳、转膜、封闭，加入封闭液稀释的一抗（兔抗ZO-1，1:500，兔抗Occludin，1∶20 000；兔抗Claudin-5，1:1 000；兔抗GAPDH，1∶10 000），4℃摇床过夜，洗涤，加入二抗（1:10 000），室温下避光震荡1 h、洗涤后图像扫描分析。

1.10 免疫荧光检测CD-31、ZO-1、Claudin-5 心脏灌注后取脑用冰冻切片机切取25 μm 脑片。经复温、漂洗、打孔、封闭，兔抗小鼠ZO-1 抗体（1∶200）、兔抗小鼠Claudin-5 抗体（1:200）分别与大鼠抗小鼠CD-31 抗体（1∶500）混合滴加，4℃孵育过夜。漂洗后用Dylight594 驴抗兔荧光二抗和Dylight488 驴抗大鼠荧光二抗混滴，37℃孵育2 h，10 μg/mL Hochest摇床孵育15 min，抗荧光衰减剂封片。应用荧光显微镜观察。

1.11 统计学处理 使用SPSS21.0 进行数据处理。非正态分布的计量资料应用非参数秩和检验。符合正态分布的计量资料以±s 表示，采用方差分析（one-way ANOVA）进行比较。检验水准α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇苷对行为学评分的影响 造模24 h与缺血再灌注组相比，白藜芦醇苷高剂量组的行为学评分得到显著改善（Z=-2.506，P＜0.05）。白藜芦醇苷低剂量组的行为学评分低于缺血再灌注组，但无统计学差异（P＞0.05），见图1。据此，笔者选择高剂量组（60 mg/kg）作为白藜芦醇苷干预组进行实验及讨论。

图1 各组行为学评分比较Fig 1 Comparison of neurological deficit score in each group

2.2 白藜芦醇苷的干预降低了脑梗死体积 与缺血再灌注组相比，术后24 h 白藜芦醇苷组显著降低了梗死体积，具有统计学意义[（33.76%±13.27%）vs.（57.47%±9.53%），t=3.555，P＜0.05]，见图2。

图2 各组脑梗死体积比较Fig 2 Comparison of infarct volume in each group

2.3 白藜芦醇苷组减轻了脑组织含水量 利用干湿重法于术后24 h 检测小鼠病灶侧半球脑含水量：白藜芦醇苷组含水量小于缺血再灌注组，差异具有显著性[（75.62%±7.95%）vs.（85.72%±6.20%），t=2.456，P＜0.05]，见图3。

图3 各组脑组织含水量比较Fig 3 Comparison of brain water content in each group

2.4 白藜芦醇苷降低了伊文思蓝的渗出 白藜芦醇苷干预后的脑组织伊文思蓝渗出量明显减低，较缺血再灌注组差异有统计学意义[（1.49±0.47）vs.（2.13±0.44），F=5.978，P＜0.05]，见图4。

图4 各组伊文思蓝渗出程度比较Fig 4 Comparison of leakage of evans blue in each group

2.5 白藜芦醇苷对紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达水平的影响 与假手术组相比，缺血再灌注组及白藜芦醇苷组紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表达均有降低，而白藜芦醇苷组相较缺血再灌注组有显著的上调（F 值分别为7.576、16.378、6.527，均P＜0.05），见图5。

图5 各组紧密连接蛋白表达水平比较Fig 5 Comparison of expression of tight junction proteins in each group

2.6 白藜芦醇苷对内皮细胞CD-31、紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5 表达分布的影响 免疫荧光显示：在皮层缺血半暗带区，白藜芦醇苷组CD-31 的表达有所增加，可见相对光滑、连续的微血管形态；缺血再灌注组微血管形态相对曲折、破碎，有明显的结构破坏（图6）。与CD-31 共标的ZO-1、Claudin-5分布于血管内皮细胞的周围，在假手术组中可见连续、索条状分布。在皮层缺血半暗带区，白藜芦醇苷明显减轻了紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5 的破坏程度（图7、8）。

图6 白藜芦醇苷改善了内皮细胞标志物CD-31（绿色荧光标记）的破坏程度Fig 6 The injury of CD-31 representing the endothelial cells（green）alleviated in PD group

图7 白藜芦醇苷组改善了紧密连接蛋白ZO-1 的破坏程度Fig 7 The degradation of tight junction proteins ZO-1 alleviated in by PD group

图8 白藜芦醇苷组可以改善了紧密连接蛋白Claudin-5 的破坏程度Fig 8 The degradation of tight junction proteins Claudin-5 alleviated in byPD group

3 讨论

从我国传统中药虎杖的根茎中提取的白藜芦醇苷，是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物[6]，是存在于自然界中最多的一种白藜芦醇化学形式[7]。近年来，大量研究表明白藜芦醇苷在保护神经细胞[4]、改善记忆[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]、抗凋亡[11]等方面均有着一定作用。已有研究证明：在梗死后大脑皮层中白藜芦醇苷上调胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（Gli1）、跨膜蛋白受体1（Ptch1）、超氧化物歧化酶1（SOD1）和Claudin-5 的表达水平及降低核因子-κB（NFκB）的表达，发挥神经保护作用[12]。在脑缺血再灌注损伤中，白藜芦醇苷抑制细胞黏附分子（CAMs）包括细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）等的表达，以发挥其保护作用[13]。另有研究表明，白藜芦醇苷可能通过激活CCAAT-增强子结合蛋白β（C/EBPβ）/肺腺癌转移相关转录因子1（MALAT1）/cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）/过氧化物酶增殖激活受体γ 协同激活因子-1α（PGC-1α）/过氧化物酶增殖激活受体γ（PPARγ）通路，同时抑制脑缺血后炎症因子的表达发挥对缺血后内皮细胞及血脑屏障的保护作用[14]。本研究中，在小鼠脑缺血再灌注损伤后行为学评分的改善、脑梗死体积的降低、脑水肿的减轻等方面，展现了白藜芦醇苷脑保护、改善梗死体积及水肿程度方面的作用。

作为血脑屏障维持通透性最主要的结构基础，紧密连接蛋白起到了重要作用[15]。其中，Claudin-5是维持血脑屏障功能的关键蛋白，在血脑屏障细胞旁途径的通透性方面起着重要的调节作用，它的破坏是很多疾病病理变化中破坏血脑屏障完整性的开端[16]。Occludin 是紧密连接蛋白中调节血脑屏障完整性和通透性的跨膜蛋白，受很多因素的调节，包括基质金属蛋白酶（MMP）的破坏、磷酸化和非磷酸化的转变、泛素化及其他细胞因子的影响。Occludin 的调节机制包括NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、Rho 激酶（RhoK）以及细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）等很多不同的通路，Occludin 的降解被认为是卒中后脑水肿及出血性转化的驱动因素[17]。ZO-1 为胞质附着蛋白中的核心环节，维系着内皮细胞间连接的空间编排和张力、肌球蛋白的活性、屏障渗透性和屏障的形成[18]。本实验中通过白藜芦醇苷的干预，观察到缺血再灌注损伤后伊文思蓝渗出的改善，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、CD-31 表达的上调，以及血管形态完整性的改善，均提示白藜芦醇苷在血脑屏障通透性、完整性的保护方面具有显著作用。

血脑屏障的破坏在缺血再灌注损伤后涵盖了两个连续的时相[19]。第一个高峰出现在3～6 h，此时血脑屏障开放，被活化的MMP-2 在血脑屏障的破坏中起到关键作用。接下来出现的第二高峰（第24～48 小时）中，活化的MMP-3、MMP-9 开始发挥其生物学效应，细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β 等在NF-κB 的激活下，进一步诱发MMP-3、MMP-9 升高其表达水平。由此产生的氧化应激可破坏内皮细胞，进而引起血管源性水肿，加剧脑组织的破坏。在缺血再灌注损伤的病理过程中，MMPs 扮演了重要角色，在血脑屏障破坏开放的两个时相中均有参与，包括起始阶段可逆性时相中被激活的MMP-2 以及第二时相里发挥主要作用的MMP-3、MMP-9[20]。

现有的研究显示，白藜芦醇苷能够通过降低NF-κB[12]，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6[9]等炎症因子的表达。TNF-α 能够通过刺激连接黏附分子-1（JAM-1）的再分布，将发挥功能的细胞转移至细胞的管腔面[21]。IL-1β 能够通过破坏紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 来增加血脑屏障的渗透性[22]。炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 不仅能够发挥自身作用加剧细胞间的通透性[23]，而且可以激活NF-κB，诱发MMP-3、MMP-9 的表达增加以破坏紧密连接蛋白，最终使血脑屏障的完整性破坏。而ICAM-1、VCAM-1 的表达能够被白藜芦醇苷抑制[13]，从而减轻ICAM-1、VCAM-1 加强炎症细胞聚集的作用，减轻脑梗死后炎症对血脑屏障完整性、通透性的影响。而白藜芦醇苷的抗氧化应激、抗凋亡作用[24]，同样可能是其发挥保护紧密连接蛋白作用的潜在机制。