基于ceRNA网络构建和免疫细胞浸润的肾乳头状细胞癌新预后特征分析

薛 津，贾微微，白丽娜，牛晓辰，王晓晖，王 丽

(山西医科大学基础医学院病理教研室，山西太原 030001)

肾细胞癌(renal cell cancer, RCC)是发生在肾脏的肿瘤，其恶性程度较高。肾细胞癌有5种组织学分型，肾乳头状细胞癌(papillary renal cell cancer，PRCC)是发病率第2的分型，约占肾细胞癌的15%～20%[1]。PRCC的治疗方式有传统的手术治疗、放化疗和分子靶向治疗，而分子靶向治疗仅有少量方式有显著效果，比如使用血管内皮生长因子和mTOR抑制剂[2-3]。然而对于已经发生转移的患者，其疗效依然非常有限[4-5]。在现有的研究结果中，PRCC相关的治疗靶点以及预后标志物十分匮乏。因此，寻找新的有关PRCC患者的治疗靶点以及预后标志物对于临床而言非常迫切。

肿瘤标记物中的lncRNA、miRNA、mRNA以及肿瘤微环境中的免疫细胞对于预测肿瘤患者的预后和肿瘤的治疗至关重要[6-9]。本文我们研究了不同类型的基因，包括lncRNA、miRNA以及mRNA，并且构建了ceRNA网络以及能够预测PRCC患者预后的基因风险模型；同时我们分析了PRCC相关的免疫细胞浸润情况，并且构建了免疫细胞风险模型；最后我们将与PRCC患者相关的风险基因以及风险免疫细胞进行共表达分析，找到其中的关系，从而找到新的PRCC潜在治疗靶点和预后标志物。

1 资料与方法

1.1 差异基因表达的数据分析从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库中下载PRCC患者的临床信息、RNA和miRNA的测序数据。我们使用R软件中的“DESeq2”包筛选出在肿瘤样本和正常样本中表达有差异的RNA分子。筛选标准为：|log2fold change (FC)|>1.0 和P<0.05。P值经过假阳性发生率(false discovery rate, FDR)校正。

1.2 ceRNA网络的构建利用R软件中的“GDCRNATools”包构建ceRNA网络。经过超几何检验和相关性分析(P<0.05)之后，留下显著相关的基因，构建ceRNA网络。ceRNA网络用Cytoscape v3.8.2进行可视化。

1.3 基因模型的建立及基因的生存分析将ceRNA网络中所有基因进行单因素Cox分析，筛选标准为P<0.05，保留显著性基因。为了防止模型的过度拟合，将保留下来的基因进行lasso回归检验，并且通过多因素Cox分析再次进行筛选，最后得到基因风险模型，通过生存曲线和ROC曲线以及列线图对基因风险模型的准确性进行验证。利用R软件中的“survival”包对ceRNA网络中的分子进行生存分析，P<0.05为此RNA分子与患者的预后显著相关。

1.4 免疫细胞模型的建立及免疫细胞的生存分析通过CIBERSORT算法对免疫细胞进行评估，去除所有表达量为0的免疫细胞，计算出剩余免疫细胞在每个样本中的相对含量。将免疫细胞进行单因素Cox分析，筛选标准为P<0.05，保留显著性免疫细胞。为了防止模型的过度拟合，将保留的免疫细胞进行lasso回归检验，并且通过多因素Cox分析再次筛选免疫细胞，最后得到免疫细胞风险模型，通过生存曲线和ROC曲线以及列线图对免疫细胞风险模型的准确性进行验证。利用R软件中的“survival”包对免疫细胞进行生存分析，P<0.05时免疫细胞与患者的预后显著相关。

2 结 果

2.1 差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA的鉴定从TCGA数据库中共下载321例原始RNA表达谱(289例PRCC样本和32例正常样本)和326例原始miRNA-sep数据(292例PRCC样本和34例正常样本)。数据中共包含了60 483个转录数据以及2 079个miRNAs数据。经过筛选后(FDR<0.05，|log2FC|>1)得到具有差异的306个lncRNA(259个上升，47个下降)、136个miRNA(59个上升，77个下降)以及2 692个mRNA(1 579个上升，1 113个下降)。

2.2 ceRNA网络和基因风险模型的构建与分析ceRNA网络共由4个lncRNA、4个miRNA及49个mRNA构建而成，其中包含5对lncRNA-miRNA及50对miRNA-mRNA(图1)。将ceRNA网络中所有的基因进行单因素分析、lasso回归以及多因素分析之后，筛选出11个基因建立风险模型，分别是ELN、COL1A1、EFEMP1、SYNGR3、DBT、KCTD15、RNF149、IKBIP、ATAD5、TCF4和hsa-miR-133a-3p，以评估患者的预后，生存曲线和ROC曲线都说明了风险模型的准确性(1年生存率ROC曲线下面积为0.956、3年生存率ROC曲线面积为0.865、5年生存率ROC曲线面积为0.8，图2A～C)。对单个基因进行Kaplan-Meier生存分析，发现COL1A1与患者生存呈负相关(P=0.002，图2D)。

图1 ceRNA网络(包含4个lncRNA、4个miRNA及49个mRNA)

A、B：基因风险模型生存曲线和ROC曲线；C：多因素Cox回归分析结果；D：COL1A1与患者生存呈负相关。图2 基因风险模型的构建以及单个基因生存分析

2.3 PRCC相关免疫细胞浸润以及免疫细胞风险模型的构建和分析通过CIBERSORT算法评估出PRCC患者主要的免疫细胞浸润类型。通过免疫细胞热图和差异分析我们发现原始B细胞(P=0.004)、原始CD4+T细胞(P=0.008)、静止CD4+记忆T细胞(P=0.002)、γδ-T细胞(P=0.007)、单核细胞(P=0.012)、巨噬细胞M0(Macrophages M0)(P=0.034)和巨噬细胞M2(P=0.005)在肿瘤样本和正常样本中有显著差异，并且巨噬细胞M0和巨噬细胞M2在肿瘤样本中明显增高。将评估出的免疫细胞浸润类型进行单因素分析、lasso回归以及多因素分析之后，仅筛选出2种免疫细胞构建风险模型，分别为巨噬细胞M0和活化的CD4+记忆T细胞(T cells CD4 memory activated)，以评估患者预后，生存曲线和ROC曲线都说明了风险模型的准确性(1年生存率ROC曲线面积0.911，3年生存率ROC曲线面积0.845，5年生存率ROC曲线面积0.841)(图3A、B、D)。对免疫细胞进行Kaplan-Meier生存分析，发现巨噬细胞M0同患者生存呈正相关(P=0.005)，活化的CD4+记忆T细胞呈负相关(P<0.001,图3C、E)。

A、B：免疫细胞风险模型生存曲线和ROC曲线；C：巨噬细胞M0同患者生存呈正相关；D：多因素Cox回归分析结果；E：活化的CD4+记忆T细胞同患者生存呈负相关。图3 免疫细胞风险模型的构建以及单个免疫细胞生存分析

2.4 ceRNA网络和免疫细胞浸润共表达分析同时我们还做了风险模型中基因和免疫细胞的共表达分析，发现DBT与巨噬细胞M0、TCF4与活化的CD4+记忆T细胞呈正相关(图4)。可以推测，基因DBT、TCF4和免疫细胞巨噬细胞M0、活化的CD4+记忆T细胞可能是PRCC患者治疗的新靶点并且能有效预测PRCC患者的预后。

A：免疫细胞之间的共表达图；C：免疫细胞与基因之间的共表达图；B、D：DBT与巨噬细胞M0、TCF4与活化的CD4+记忆T细胞呈正相关。图4 基因与免疫细胞共表达分析

3 讨 论

PRCC是一种高度异质性的疾病，具有不同的形态特征和生物学行为[10]。肿瘤标记物和免疫细胞浸润对于肿瘤的诊断与治疗十分重要，但是大部分研究都聚焦在ccRCC，对于PRCC研究甚少。因此我们综合TCGA数据库中的基因数据以及PRCC患者免疫细胞浸润情况进行研究，进一步探究其新的潜在治疗靶点以及预后标志物。

我们构建了PRCC相关的ceRNA网络、基因风险模型和免疫细胞风险模型。两个风险模型共包含11个基因和2种免疫细胞，分别是ELN、COL1A1、EFEMP1、SYNGR3、DBT、KCTD15、RNF149、IKBIP、ATAD5、TCF4和hsa-miR-133a-3p，以及巨噬细胞M0和活化的CD4+记忆T细胞。以上基因以及免疫细胞和PRCC患者的预后相关，通过这两个风险模型可以很好地预测PRCC患者的预后。我们还发现DBT与巨噬细胞M0、TCF4与活化的CD4+记忆T细胞呈正相关，可以推测这两对基因与免疫细胞以及他们的作用机制对PRCC患者的风险预测和治疗有意义。

巨噬细胞在肿瘤中是一把双刃剑，具有促进肿瘤发展以及抗肿瘤作用，在肿瘤中具体发挥哪种作用则取决于肿瘤微环境中一系列信号因子的调节，包括细胞因子和趋化因子等[11]。在巨噬细胞中，M0为未激活亚型，不表现出炎症或肿瘤相关功能，而M0可以分化为M1和M2两种激活亚型，M1和M2具有直接的免疫调节作用[12-14]。免疫细胞热图和差异分析结果表明，M2在PRCC肿瘤组织中明显增高。有研究表明人类PRCC细胞分泌IL-8、CXCL16等趋化因子，并且这些因子可以在体外吸引原代人单核细胞，长期培养之后转化为典型的M2型泡沫状巨噬细胞[15]，这可能是M2在PRCC肿瘤组织中增高的原因。在PRCC患者中，M1与患者的生存呈正相关，并且可以抑制肿瘤的远处转移，具有抗肿瘤作用[16-18]。我们的研究发现M0与PRCC患者的生存呈正相关，可以推测M0通过分化为M1进而发挥抗肿瘤作用。共表达研究发现DBT与M0呈正相关，可以通过增强DBT来间接提高患者的生存率。由于有关DBT与M0之间的研究较少，所以具体的机制还需进一步探索。

CD4+T细胞是体液和细胞免疫反应的中枢调节细胞，对于B细胞进行同型转换以产生高亲和力抗体以及巨噬细胞的杀伤作用都有至关重要的作用，其中CD4+记忆T细胞可能在保护性免疫反应的维持和控制中发挥重要的促进作用[19]。有文献报道，在ccRCC中，高风险患者组活化的CD4+记忆T细胞升高[20]，在结直肠癌中，活化的CD4+记忆T细胞在肿瘤组织中明显增高，并且在T1～2期中含量高于T3～4期[21]。这些结果提示活化的CD4+记忆T细胞与患者的风险度相关。我们的研究同样说明了这一点：活化的CD4+记忆T细胞与PRCC患者的生存呈负相关。共表达分析发现，TCF4与活化的CD4+记忆T细胞呈正相关，TCF4功能增强可以诱导Wnt靶基因转录，促进细胞增殖、侵袭和诱导上皮间充质转化[22]，这可能是PRCC患者高风险的原因之一，抑制TCF4的功能可能会有利于患者预后。Wnt通路与TCF4以及T细胞的分化激活都密切相关[23-24]，这可能与二者在PRCC中的联系有关，还需进一步研究确认。

另外，有研究发现，ELN与PRCC患者的预后相关[25]，这可能是因为ELN编码弹性蛋白，而这种蛋白是肿瘤微环境中的关键蛋白[26]，这与我们的结论相一致；另有研究表明，DUXAP8和DUXAP9表达与PRCC患者的预后呈负相关，而COL1A1被鉴定为DUXAP8和DUXAP9的功能靶基因[27]，我们的结果显示COL1A1与PRCC患者的预后呈负相关，因此可以推断DUXAP8和DUXAP9对PRCC患者的影响可能是通过COL1A1进行的。

这些基因和免疫细胞在其他肿瘤研究中也有着重要作用，例如hsa-miR-133a-3p在口腔癌[28]、肠癌[29]以及非小细胞肺癌[30]中都是重要的诊断和预后标志物，在RS4;11细胞系中下调KCTD15基因后可以诱导细胞凋亡和死亡，提示该蛋白在细胞稳态和增殖中发挥作用[31]；结直肠癌以及ccRCC的肿瘤组织中M0含量均增高[21，32]，并且在ccRCC中，M0与患者的生存率呈负相关[32]。这些基因与免疫细胞的研究显示出了巨大的潜力，不仅对PRCC患者有重要意义，同时也是其他癌症诊断的生物标志物。

综上所述，我们构建了PRCC相关ceRNA网络以及基因和免疫细胞风险模型，发现了PRCC患者新的可能的治疗靶点以及预后标志物，共包含11个重要的基因、2个重要的免疫细胞以及2对基因与免疫细胞之间的关系，为PRCC患者的治疗提供了新思路。