基于生物信息学分析prohibitin在肾透明细胞癌中的表达及意义

杨文军，朱炜玮

1解放军总医院第六医学中心急诊医学科，北京 100048

2解放军总医院第七医学中心泌尿外科，北京 100027

肾细胞癌也称为肾癌，是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，流行病学统计数据显示，肾癌的发病率、病死率均呈逐渐上升趋势[1]。肾透明细胞癌是最常见的肾癌类型，发病率占全部肾癌的75%[2]。目前，手术仍是早期肾透明细胞癌的首选治疗方法。转移性晚期肾透明细胞癌患者对放化疗的敏感性较差，可选择的治疗方法较少。即使早期接受手术治疗，亦有20%～50%的患者存在复发风险，30%的患者存在远处转移风险[3-4]。因此，需要探索一种新的肾透明细胞癌治疗策略，如分子靶向治疗，但仅20%～40%的肾透明细胞癌患者对现有的靶向治疗有效[5]，且其长期生存率并未发生明显改善[6]。因此，需寻求新的与患者临床特征及预后相关的基因，为肾透明细胞癌的治疗提供新的靶点与目标。

prohibitin（PHB）属于SPFH家族成员，广泛参与正常细胞增殖、迁移和凋亡等生理学过程，在肥胖、衰老、肿瘤发生发展等过程中发挥了重要作用[7-9]。有研究表明，PHB是一种潜在的抑癌基因，可以影响膀胱癌、食管癌等肿瘤细胞增殖、转移过程[10]。但目前有关PHB在肾透明细胞癌中的表达及与肿瘤发生发展的关系尚未明确。本研究基于生物信息学分析PHB在肾透明细胞癌中的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 PHB基因表达水平分析

通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库、人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库（http:/www.proteinatlas.org）[11]检索PHB基因，条件设定为tissue，可获得PHB基因在人体不同组织中的表达水平。通过UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）[12]分析PHB基因在肾透明细胞癌组织和正常肾脏组织中的表达水平，设置参数：基因PHB，肿瘤类型kidney renal clear cell carcinoma，分型类型选择expression。

1.2 PHB基因表达水平与肾透明细胞癌患者临床特征和预后的关系

通过UALCAN数据库评估PHB基因表达水平与肾透明细胞癌患者临床特征的关系，包括性别、淋巴结转移情况和分化程度。通过基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）[13]分析PHB基因表达水平与肾透明细胞癌患者生存情况的关系。设置参数：基因PHB，肿瘤类型为kidney renal clear cell carcinoma，生存分析类型为overall survival；取cut-off-high（%）为50%，cut-offlow（%）为50%。

1.3 PHB基因相互作用靶点的获取及蛋白质互作（proteinprotein interaction，PPI）网络的构建

通过 String数据库（https://string-db.org/）[14]检索出20个与PHB基因相互作用的关键蛋白，构建PPI网络，物种类型设定为human，置信度选择“Medium 0.4”，相互作用最大数选择20。

1.4 基因本位（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

将交集基因输入在线网站DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO、KEGG分析。

1.5 统计学方法

通过TCGA、UALCAN、String等数据库统计数据，非正态分布计量资料以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHB基因相对表达量的比较

通过HPA数据库分析PHB基因在人体正常组织中的表达情况显示，PHB在肾脏、甲状腺及心脏组织中高表达，在正常肾脏组织中的表达丰度较高，提示PHB在肾脏组织中可能发挥了重要作用。同样，本研究通过UALCAN数据库分析PHB基因在肾透明细胞癌（n=72）及正常肾脏组织中（n=533）的表达情况，结果显示，PHB基因在肾透明细胞癌组织中的相对表达量为118.001（101.249，137.871），明显低于正常肾脏组织的209.904（190.427，237.008），差异有统计学意义（P＜0.01）。（图1）

图1 PHB在人体各组织中的表达丰度

2.2 不同临床特征肾透明细胞癌患者肿瘤组织中PHB基因相对表达量的比较

不同淋巴结转移情况肾透明细胞癌患者肿瘤组织中PHB基因相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；男性、未分化肾透明细胞癌患者肿瘤组织中PHB基因相对表达量分别低于女性、低中高分化患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 533例不同临床特征肾透明细胞癌患者肿瘤组织中PHB基因的相对表达量[M（P25，P75）]

2.3 PHB基因相对表达量与肾透明细胞癌患者预后的关系

依据PHB基因相对表达量，取cut-off-high（%）为50%，cut-off-low（%）为50%，将肾透明细胞癌患者分为PHB高表达组（n=258）和PHB低表达组（n=258），因部分患者随访资料不全，因此总例数少于533例，结果显示，PHB低表达组肾透明细胞癌患者总生存期短于PHB高表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明PHB低表达可能与患者的预后不良相关。（图2）

图2 PHB高表达组（n=258）和PHB低表达组（n=258）肾透明细胞癌患者的总生存曲线

2.4 PHB相互作用蛋白的PPI网络

将PHB基因相互作用的交集靶点导入String数据库，得到PPI网络，共筛选出20个PHB基因相互作用的蛋白，分别为SPG7、AFG3 ATP酶家族基因3样2多克隆抗体（AFG3 like matrix AAA peptidase subunit 2，AFG3L2）、PHB2、内质网脂质Raft关联蛋白（ER lipid raft associated，ERLIN）1、ERLIN2、SOS-Ras/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子1（SOS Ras/Rac guaninenucleotide exchange factor1，SOS1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷脂酰肌醇-4，5二磷酸 3-激酶催化亚单位γ（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma，PIK3CG）、鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子（Ral guanine nucleotide dissociation stimulator，RALGDS）、MLLT4、重组人Ras相关蛋白Krev-1（Ras-related protein Krev-1，RAP1A）、酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein，delta polypeptide，YWHAZ）、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白β（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein beta，YWHAB）、迅速加速纤维肉瘤1（rapidly accelerated fibrosarcoma 1，RAF1）、鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）、磷脂酰肌醇-4，5二磷酸3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）、鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、丝裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAP2K1）、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白eta（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein eta，YWHAH）。（图3）

图3 PHB相互作用蛋白的PPI网络

2.5 GO分析结果

对20个蛋白对应的基因进行GO分析，结果显示，细胞成分主要集中于细胞内液、细胞质、细胞质膜及线粒体等，生物进程主要集中于细胞内信号转导、细胞死亡调控及细胞凋亡调控等，分子功能主要集中于蛋白结合、ATP结合、蛋白酶激活等。（图 4）

图4 GO分析结果

2.6 KEGG通路富集分析结果

对这20个蛋白对应的基因进行KEGG通路富集分析，结果显示，这些基因主要富集于磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路、免疫反应相关通路等。（图5）

图5 KEGG通路富集分析结果

3 讨论

相关研究显示，肾癌发病率占所有恶性肿瘤的2%～3%[15]。肾透明细胞癌作为肾癌中最常见的类型，在中国及全球的发病率也不断上升。2020年，肾透明细胞癌每年新发病例超过40万例，病死超过15万例[16]。早期肾透明细胞癌患者主要采用外科手术治疗，而中晚期患者多已经失去了最佳的手术治疗时机。因此，寻找一种早期诊断及预后评估的相关分子标志物迫在眉睫。

PHB基因广泛表达于细胞核、细胞质、细胞膜及线粒体上[17-18]。已有研究表明，PHB参与调节细胞周期、细胞凋亡、DNA转录等多种生理过程[19]。PHB可以通过调控E2F、Rb等转录因子的表达及RAS/RAF/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路参与细胞周期的调节，而促凋亡机制主要通过对细胞线粒体、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）等凋亡相关蛋白的调控完成[20]。研究显示，PHB在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的发生发展、转移过程中发挥了重要作用[21-22]，但关于PHB基因在肾癌中表达及在肾癌发展过程中的作用机制均未见相关研究报道。

本研究利用TCGA数据库中肾透明细胞癌相关数据，分析PHB基因在肾透明细胞癌中表达及与患者临床特征和预后的关系，结果显示：①通过HPA数据库发现，PHB在正常肾脏组织中高表达，提示其在肾脏正常生理过程中可能发挥了重要作用，但通过UALCAN数据库中分析PHB基因在正常肾脏组织及肾癌组织中的表达情况发现，PHB在肾透明细胞癌组织中明显低表达。②通过UALCAN数据库分析PHB与肾透明细胞癌患者临床特征的关系发现，PHB的表达水平与肾透明细胞癌患者淋巴结转移情况无关，与性别、分化程度有关。③通过GEPIA数据库分析PHB与肾透明细胞癌患者预后的关系发现，PHB低表达组肾透明细胞癌患者总生存期短于PHB高表达组。④通过String数据库筛选出20个与PHB基因相互作用的蛋白质，其对应基因通过DAVID在线进行GO及KEGG富集分析，结果显示，PHB的表达可能与细胞凋亡、细胞黏附、免疫耐受有关；PI3K/AKT通路可能参与了细胞增殖及凋亡过程，可明显促进肿瘤细胞生长，与肝癌、卵巢癌的发生发展密切相关[23]，而PHB是否通过PI3K/AKT通路在肾透明细胞癌发生发展、转移过程中发挥作用至今仍未见报道，可考虑作为以后研究的一个方向。

综上所述，本研究基于TCGA等数据库，通过对肾透明细胞癌中PHB相关信息的分析发现，PHB基因在肾透明细胞癌组织中低表达，且其表达水平与患者的预后有关，表明PHB对肾透明细胞癌的诊断、分期、分级、治疗及预后评估均有较高的价值。虽然通过相关数据分析可以为PHB与肾透明细胞癌关系的研究提供相关线索，但其具体的作用机制、信号通路仍需要进一步的基础实验去证实，使PHB成为一种新的分子标志物应用于临床对肾透明细胞癌的早期诊断、治疗及预后评估成为可能。