孕期慢性应激通过胎盘GC 屏障致子代情绪损伤的机制

刘红娅， 马淑琴， 陈小惠， 戚发秋， 赵 枫， 付有娟， 关素珍

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004； 2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院，银川 750004）

随着社会经济的发展，儿童神经精神性疾病，如焦虑症、孤独症等受到社会的广泛关注。越来越多的研究[1]表明，子代神经精神类疾病的发病与母亲孕期应激刺激有极大的联系。孕期长期处于应激状态会引起胎儿暴露于过量糖皮质激素（glucocorticoid，GC）[2]，主要为皮质醇，通过胎盘进入宫内，引起胎儿下丘脑-垂体-肾上腺（The hypothalamic pituitary adrenal，HPA）轴改变，导致子代情绪和认知发育异常[3]。在正常妊娠中，胎儿的GC 暴露是由胎盘GC 屏障决定的，胎盘GC 屏障需要11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2，11β-HSD2）和P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）共同调节，以保证适量却不超量的GC。11β-HSD2 可将GC 从有活性状态转化为无活性状态[4]，P-gp 能逆浓度将GC转运到母体面[5]，且GC 受体亚家族3C 组成员1（Nuclear Receptor Subfamily 3，Group C，Member 1，NR3C1）在HPA 轴功能紊乱过程中发挥着重要作用[6-7]。目前，孕期慢性应激对胎盘GC 屏障的具体调节机制尚不清楚。本研究拟建立孕期慢性应激大鼠模型，观察子鼠情绪变化，通过检测胎盘GC 屏障相关基因的表达，探讨GC 屏障与子代情绪之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选择成年SPF 级未曾受孕的80～90 日龄SD雌性大鼠32 只，体质量（200±20）g，随机分为模型组和对照组，每组16 只。模型组为单笼饲养，对照组4 只/笼饲养。90 日龄以上雄鼠24 只，体质量（220±20）g，分为模型交配组16 只和对照交配组8 只，4 只/笼饲养，雄鼠只为交配所用。均购自宁夏医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（宁）2020-0001。本研究经宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准，编号为IACUC-NYLAC-2020068。

1.2 主要试剂和仪器

131I 皮质醇放射免疫试剂盒（北京北方生物技术研究所，中国），蔗糖（北京化学试剂，中国），β-actin 抗体（Santa，美国），11β-HSD2 一抗（Novus，美国），P-gp 一抗（abcam，美国），NR3C1 一抗（abcam，美国），山羊抗兔IgG 二抗（affnity，中国）等；电泳仪（北京市六一仪器厂），Smart 3.0 小动物行为学视频记录与分析系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国）。

1.3 孕期慢性应激模型建立

1.3.1 模型建立方法 适应性饲养7 d 后，选择慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立孕期CUMS 动物模型[8]。根据实验室条件选择应激方式：（1）24 h 拥挤环境；（2）24 h 潮湿环境（湿度60%～70%）；（3）5 min热水游泳（45 ℃）；（4）30 min 摇晃鼠笼；（5）行为束缚2 h；（6）5 min 冰水浴；（7）夹尾2 min（距尾根部1 cm 处）。利用随机数字表法将7 种刺激方式随机安排到28 d 内，每天1 种，应激完成后放回原饲养笼中。

在应激周期第7 天，模型组雌鼠与模型交配组雄鼠（1∶1）进行合笼交配，次日早晨检查雌鼠阴栓（或阴道涂片），明确妊娠后，将雌雄鼠分离，模型组孕鼠继续单笼饲养，在合笼过程中，应激照常进行。对照组雌鼠与对照交配组雄鼠（2∶1）进行合笼交配，确定妊娠后，雌雄分离，对照组孕鼠4 只/笼，在孕18 d 开始单笼饲养。

1.3.2 确认模型成功与否 利用行为学变化及血浆皮质酮来确认孕期CUMS 大鼠模型的成功建立[9-10]。在应激前1 d 和应激第1、7、14、21、28天内眦静脉采血收集血浆，-80 ℃冰箱冷冻待测。同时期进行旷场实验（open field test，OFT）、蔗糖偏好实验（sucrose preference test，SPT）测定母鼠的行为学。

1.4 子鼠分组及样品收集

确认怀孕的第18 天，每组各取8 只孕鼠进行剖宫收集胎盘，-80 ℃冰箱冷冻保存。其余8只孕鼠分娩后获得子鼠，所有子鼠于一周内全部娩出，子鼠出生的当天记为PND0（postnatal day 0，PND0），PND21 断乳，每组按每笼的分娩只数及性别比例从不同窝别中随机抽取16 只子鼠（雌雄各半），记为对照子鼠组和模型子鼠组，雌雄分笼，4 只/笼饲养。PND28 与PND42，记录子鼠体质量并内眦静脉采血收集血浆，-80 ℃冰箱冷冻待测。

1.5 指标测定和方法

1.5.1 血浆皮质酮测定 利用131I 皮质醇放射免疫试剂盒测定血浆皮质醇浓度，根据公式：C 皮质酮=50 × C 皮质醇，得到皮质酮浓度。

1.5.2 母鼠行为学测定 （1）OFT[11]：选择OFT反映箱进行实验，呈立方体（100 cm×100 cm×50 cm），周壁为黑色，底部由25 等分的方块组成。每只大鼠测定时间为5 min，水平运动得分以动物经过的底面块数计数，动物3 爪以上跨入方格内记为1 分；垂直运动得分以直立次数计数，1 次记为1 分。并记录清洁运动次数（大鼠做洗脸样动作）和粪便粒数，每只大鼠开始前彻底清洁敞箱。（2）SPT[12]：分为适应训练部分和测试部分。首先训练大鼠适应含糖饮水，每笼放置2 个装有1%蔗糖水的水瓶自由饮水24 h，第2 天将其中的一瓶换成纯水，适应结束后，禁食禁水24 h，次日给予1 瓶1%蔗糖水，1 瓶纯水，自由饮水1 h后称重。其余时间给予正常饮食。1%蔗糖偏爱百分比=蔗糖水消耗/总液体消耗×100%。

1.5.3 子鼠行为学测定 在PND42 开始，进行子鼠行为学的测定，OFT 和SPT 具体方法同母鼠行为学测定，连续测量3 d，取平均值。在PND45时，开始悬尾实验（tail suspension test，TST）[13]，具体操作：将大鼠呈倒悬状态固定在TST 箱上（距子鼠尾尖约5 cm），确保子鼠头部距台面约为20 cm。主要指标为6 min 内的“静止”时间，表现出“失望”状态，并追踪子鼠的挣扎轨迹。连续测定3 d，取平均值。

1.5.4 胎盘GC 屏障相关蛋白11β-HSD2、NR3C1、P-gp 表达的测定 Western blot 测定胎盘GC 屏障相关蛋白11β-HSD2、NR3C1、P-gp 的含量，每100 mg 待测胎盘组织中加入0.8 mL RIPA Lysis Buffer 制备成匀浆后，离心，取上清，采用BCA 法进行蛋白定量。上样缓冲液与样品按5∶1 体积比例进行混合，上样蛋白50 μg，进行凝胶蛋白电泳，采用湿转法将凝胶转移至0.45 μm 的PVDF膜，封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜，回收一抗，加入二抗，显色后以目的蛋白11β-HSD2、P-gp、NR3C1 与β-actin 蛋白的光密度（OD）的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验；母鼠相关数据的比较采用重复测量的方差分析；相关性分析采用Pearson 相关分析。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 孕期慢性应激致母鼠血浆皮质酮水平增高

经重复测量方差分析，慢性应激对母鼠皮质酮水平有影响（F=41.399，P＜0.05），模型组皮质酮水平随应激时间的变化而变化（F=4.440，P＜0.001），分组与时间点的交互作用差异无统计学意义（F=1.134，P＞0.05）。同一时间点两组比较发现，模型组血浆皮质酮浓度在应激第14、21、28天均高于对照组（t14=2.412，P ＜0.05；t21=2.822，P＜0.05；t28=2.956，P＜0.05）。表明模型组母鼠在孕期处于应激状态，见表1。

表1 应激对母鼠血浆皮质酮浓度的影响（±s，ng·mL-1）

表1 应激对母鼠血浆皮质酮浓度的影响（±s，ng·mL-1）

*P＜0.05。

组别n应激前1 d应激第1 天应激第7 天应激第14 天应激第21 天应激第28 天对照组8325.74±12.57368.31±59.20227.45±127.60285.63±81.64341.78±48.40320.43±84.76模型组8367.99±52.66388.09±77.40320.86±86.86394.02±97.41* 444.12±90.43* 463.71±107.76*?

2.2 孕期慢性应激致母鼠行为学改变

SPT 结果经重复测量方差分析，组间比较发现，模型组1%蔗糖偏爱百分比与对照组之间差异有统计学意义（F组间=15.053，P＜0.05；F组内=1.547，P＞0.05；F交叉=2.224，P＞0.05），同一时间点两两比较发现，模型组1%蔗糖偏爱百分比在应激第 14、21 天均低于对照组（t14=-3.922，P＜0.05；t21=-2.870；P＜0.05），见图1。模型组蔗糖消耗量与对照组之间差异有统计学意义（F组间=2.345，P＜0.05；F组内=72.802，P＜0.05；F交叉=3.669，P＜0.05），进一步两两比较发现：在应激14 d 模型组蔗糖水消耗量、液体总消耗量均低于对照子鼠组（t14蔗糖消耗量=-4.025，P＜0.05；t14液体总消耗量=-2.484，P＜0.05）。

OFT 结果经重复测量方差分析，组间比较发现，模型组水平运动得分与对照组差异有统计学意义（F组间=4.368，P＜0.05；F组内=4.384，P＜0.05；F交叉=4.824，P＞0.05），模型组垂直运动得分与对照组存在差异（F组间=4.215，P＜0.05；F组内=5.649，P＜0.05；F交叉=1.638，P＞0.05），进一步两两比较发现，在应激第7、21、28 天模型组水平得分均低于对照组（t7=-4.018，P＜0.05；t21=-0，664，P＜0.05；t28=-2.444，P＜0.05），在应激第21 天模型组垂直运动得分低于对照组（t21=-2.447，P＜0.05），见图1。

图1 孕期慢性应激致母鼠行为学改变

2.3 孕期慢性应激对子代的影响

2.3.1 孕期慢性应激致子代体质量降低 与对照子鼠组相比，模型子鼠组PND28、PND42 体质量均低于对照子鼠组（P 均＜0.05），见表2。

2.3.2 孕期慢性应激致子代血浆皮质酮浓度升高 模型子鼠组的血浆皮质酮浓度与对照子鼠组差异有统计学意义（P＜0.05），在PND28 和PND42时，模型子鼠组的血浆皮质酮水平均高于对照子鼠组（P 均＜0.05），见表2。

表2 孕期慢性应激对子代体质量和血浆皮质酮的影响（±s）

表2 孕期慢性应激对子代体质量和血浆皮质酮的影响（±s）

组别n体质量/g血浆皮质酮/（ng·mL-1）PND28PND42PND28PND42对照子鼠组1697.29±26.87195.23±25.84413.91±53.86277.53±91.12模型子鼠组1675.69±19.26175.59±19.45504.11±132.72415.30±150.47 t 值-2.429-2.6142.5193.133 P 值0.0140.0210.0200.004

2.3.3 孕期慢性应激致子代焦虑、抑郁样行为 模型子鼠组的水平运动得分低于对照子鼠组（P＜0.05），表明模型子鼠组较对照子鼠组的探究行为减少，处于紧张状态。模型子鼠组的糖水消耗量、液体总消耗量和1%蔗糖偏爱百分比均低于对照子鼠组（P 均＜0.05）。模型子鼠组与对照子鼠组的静止时间差异有统计学意义（P＜0.05），模型子鼠组静止时间长于对照子鼠组，表明模型子鼠组处于失望、抑郁状态，见表3。

表3 孕期慢性应激致子鼠行为学改变（±s）

表3 孕期慢性应激致子鼠行为学改变（±s）

组别nOFT/分SPTTST水平运动垂直运动 蔗糖水消耗/mL 液体总消耗/mL 1%蔗糖偏爱百分比/%静止时间/s对照子鼠组 16 67.54±17.16 13.67±5.128.14±1.7113.21±1.7160.75±7.1752.17±38.94模型子鼠组 16 49.58±27.34 9.79±6.756.55±1.6011.73±1.7039.36±19.8998.03±56.22 t 值-2.225-1.829-2.704-2.444-4.0472.791 P 值0.0340.0770.0110.021＜0.0010.009

2.4 孕期慢性应激对子代胎盘GC 屏障相关蛋白表达的影响

子鼠胎盘组织Western blot 条带图结果显示：模型子鼠组胎盘组织GC 相关蛋白11β-HSD2、P-gp 的相对表达均低于对照子鼠组（t=2.485，P ＜0.05；t=2.420，P ＜0.05），NR3C1 的相对表达高于对照子鼠组（t=2.240，P＜0.05），见图2。

图2 胎盘GC 屏障相关蛋白变化

2.5 子鼠情绪损伤与GC 屏障相关蛋白的相对表达的相关性分析

相关性分析显示，子鼠胎盘GC 屏障相关蛋白11β-HSD2、P-gp 的相对表达与OFT 的水平运动得分均呈正相关（P 均＜0.05），与SPT 的蔗糖水消耗、1%蔗糖偏爱百分比均呈正相关（P 均＜0.05），与TST 的静止时间呈负相关（P＜0.05）；子鼠胎盘GC 屏障相关蛋白NR3C1 的相对表达与OFT 水平运动、垂直运动得分均呈负相关（P 均＜0.05），与TST 的静止时间呈正相关（P＜0.05），与SPT 蔗糖水消耗、1%蔗糖偏爱百分比均呈负相关（P 均＜0.05），见表4。

表4 子鼠情绪损伤与胎盘GC 屏障相关蛋白的相对表达相关性分析（r 值）

3 讨论

本研究通过建立孕期慢性应激动物模型发现，模型组的血浆皮质酮水平在应激第14、21、28 天均较高于对照组，与文献[14]的研究结果相似，模型组母鼠的糖水偏爱度降低，旷场试验的活动度和探索能力均降低，与以往的研究[15]结果相似，结果提示：模型组处于应激状态。此次造模周期为28 d，在应激第7 天合笼，母鼠在孕期以及怀孕期间都接受应激刺激，在造模过程中发现，模型组和对照组在应激第7、14 天的血浆皮质酮水平较应激前1 d 和应激第1 天均有降低趋势，引起这一结果的原因可能是第7 天为雌雄合笼的第1 天，第14 天合笼结束，大鼠当时所处的状态为怀孕初期和交配期，这一时期的激素水平不稳，这一现象可作为后期研究的切入点进行深入研究。

研究[16]表明，孕期长期焦虑会增加低体质量儿等不良妊娠结局的发生。本研究结果显示，在PND28、PND42 模型子鼠组的体质量均低于同期对照子鼠组，与相关研究[17]结果一致，说明孕期慢性应激致子代体质量偏低。本研究结果表明，在PND28、PND42 模型子鼠组血浆皮质酮水平均高于对照子鼠组，有研究[18]提到，孕期受到应激刺激，会激活母亲自身HPA 轴改变，产生大量的皮质醇，致使子代的皮质酮升高，影响子代的情绪、认知能力，表明孕期应激会使子代的血浆皮质酮升高。

目前多采用OFT 来反映动物对新环境的恐惧、焦虑状态[19]。本研究结果显示，相对于对照子鼠组，模型子鼠组对于新鲜事物的探索行为和适应能力降低，与赵枫等[20]研究结果一致。SPT 是一种反映快感是否缺失的指标[12]，结果显示，模型子鼠组的蔗糖水消耗和1%蔗糖偏好百分比均低于对照子鼠组，表明孕期慢性应激导致子代对幸福事件的反应能力下降，与Lu 等[21]研究结果一致。STT 是反映失望情绪较经典的试验方法[22]，结果显示，孕期慢性应激会致使子代对被迫体位的反抗能力降低，表现出失望、抑郁状态，与甄凤亚等[23]研究结果类似。以上结果均表明孕期慢性应激可导致子鼠出现焦虑、抑郁情绪。

母体GC 进入胎盘和胎儿是通过胎盘GC 屏障调控的，胎盘组织中11β-HSD2、P-gp 和NR3C1 含量丰富，且与胎盘GC 屏障的开放有密切关系[24-25]。本研究发现，模型子鼠组胎盘GC 屏障关键基因11β-HSD2 相对表达下调，表明被代谢灭活的GC 含量减少，与相关研究[26]结果相似；P-gp 的相对表达下调，表明从胎儿面外将GC 排至母体面的量减少，与以往的研究[27]一致。蛋白NR3C1 的相对表达上调，表明与GC 受体NR3C1结合的GC 含量增加，与相关研究[28]结果相似。以上结果均表明，模型子鼠组暴露于高皮质酮水平。结合相关性分析结果，孕期慢性应激子鼠情绪损伤与胎盘GC 屏障相关蛋白11β-HSD2、Pgp 的相对表达下降，NR3C1 的相对表达升高有关。正如孕期慢性应激引起机体HPA 轴持续激活，致使母体产生大量的GC，引起胎盘GC 屏障改变，影响胎儿的HPA 轴，进而影响胎儿情绪、认知等方面[29-30]。

综上所述，孕期慢性应激导致子鼠出现焦虑、抑郁情绪，其机制可能与胎盘GC 屏障关键调节基因11β-HSD2、P-gp 和NR3C1 的异常表达有关。近些年，孕期母体的焦虑引起胎盘GC屏障相关基因DNA 甲基化程度异常，并在出生后长期存在，最终造成胎儿HPA 轴功能失调及出生后神经行为异常的研究逐渐增多，因此，接下来我们将进一步确定胎盘GC 屏障相关基因的异常甲基化，以及甲基化终生GC 反应和HPA 轴失调致认知发育损伤的机制，这对于探究成年疾病的胎儿起源和寻找阻断胎盘GC 屏障改变的分子靶标，具有重要的理论和实践意义。