不同水平硒对oxLDL 诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用

郎艳芝， 王 雷， 李 娜， 杨 文， 冉林武，

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004； 2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学实验动物中心，银川 750004）

血管内皮细胞是构成动脉、静脉和毛细血管的一层单层内皮细胞，是血液和组织之间的天然屏障[1]。血管内皮细胞损伤与高血压、糖尿病、冠心病、心肌病、动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程密切相关[2]。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）能够诱导血管内皮细胞氧化应激，降低细胞抗氧化能力，引起血管内皮细胞氧化损伤[3]。目前，通过降低氧化应激改善血管内皮细胞功能，已成为预防和治疗心血管疾病的一种策略[4]。硒是人体必需的微量元素之一，流行病学发现硒具有预防心血管疾病的功效[5-6]。硒主要通过硒蛋白发挥抗氧化作用，进而起到保护血管内皮细胞的功能。但硒浓度变化如何影响硒蛋白的生物学功能，特别是对心血管系统的影响，仍有待进一步研究。本文以人脐静脉内皮细胞（EA.hy926 细胞）为研究对象，观察不同硒浓度对oxLDL 诱导EA.hy926 细胞氧化损伤的保护作用，探讨血管内皮细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）1 和GPx4 的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

EA.hy926 细胞购自上海科学院细胞库；亚硒酸钠（Na2SeO3）购自西亚试剂；oxLDL 购自广州奕源生物科技有限公司；高糖型DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Gibco 公司；青霉素链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶消化液购自北京Solarbio 公司；磷酸盐缓冲液购自美国Hyclone 公司；MTT细胞增殖检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE 凝胶试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程公司；总GPx 检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；β-Actin 抗体购自北京中杉金桥公司；GPx1 抗体购自美国Santa Cruz 公司；GPx4 抗体购自美国Abcam 公司；JC-1 检测试剂盒、HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体、HRP 标记山羊抗鼠IgG 抗体购自美国Abbkine 公司；ECL 发光液购自美国Thermo 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 EA.hy926 细胞培养于DMEM高糖完全培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗）中，置于37 ℃，含5% CO2恒温培养箱中培养。当EA.hy926 细胞铺满T25 培养瓶底部70%时，开始进行后续实验。

1.2.2 MTT 法测定细胞存活率 将EA.hy926 细胞培养在T25 培养瓶中，待细胞生长融合至70%时，PBS 液清洗1 次，加入含0.5%胎牛血清的高糖DMEM 培养基培养24 h。PBS 液清洗细胞1次，加入用含0.5%胎牛血清的高糖DMEM 配制的不同浓度的0、0.05 和0.5 μmol·L-1Na2SeO3培养基。培养24 h 后，将不同硒浓度的细胞用PBS 液清洗1 次，分别加入1 mL 含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化液消化，重悬计数，细胞按1.5×104个/mL 的浓度接种于96 孔板，每孔200 μL，培养8 h 后，分为6 组：缺硒组（0 μmol·L-1Se），正常硒组（0.05 μmol·L-1Se），补充硒组（0.5 μmol·L-1Se），缺硒（0 μmol·L-1Se）+oxLDL组，正常硒（0.05 μmol·L-1Na2SeO3）+oxLDL 组，补充硒（0.5 μmol·L-1Na2SeO3）+oxLDL 组，oxLDL浓度为100 μg·ml-1，每组6 个重复孔，继续培养16 h。培养结束后，弃旧培养基，每孔加入50 μL的1 mg·mL-1MTT 溶液，在培养箱内避光孵育4 h，弃去MTT 溶液，每孔加入150 μL 的二甲基亚砜（DMSO），室温避光摇床振荡15 min，充分溶解甲瓒晶状体。同时设置空白调零孔。使用酶标仪在490 nm 处检测各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组吸光度值-空白孔吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。

1.2.3 EA.hy926 细胞内GPx、SOD 和MDA 的测定 待细胞在培养瓶中生长融合至70%时，加入含0.5%胎牛血清的高糖DMEM 培养基培养24 h。更换培养基为含不同硒浓度的培养液继续培养细胞24 h。然后，将细胞分为6 组继续培养16 h。培养结束后，吸去上清，PBS 液清洗1 次，用0.25%的胰酶室温消化1 min，加培养基终止消化。1 000 r·min-1，离心3 min 弃去培养基。加入1 mL的PBS 液轻轻吹打细胞沉淀，再次1 000 r·min-1，离心3 min 弃去PBS 液，收集细胞。根据试剂盒说明，检测细胞内GPx、SOD 和MDA 的含量。

1.2.4 DCFH-DA 探针检测EA.hy926 细胞内的ROS 按照1.2.2 中所述，将培养在不同浓度Na2SeO3（0、0.05、0.5 μmol·L-1）中的细胞调整为1×105个/L 接种于24 孔板，培养8 h 后，将细胞分为缺硒组、正常硒组、补充硒组、缺硒+oxLDL组、正常硒+oxLDL 组、补充硒+oxLDL 组，继续培养16 h，每组设3 个重复。培养结束后，ROS 阳性组细胞用12 μmol·L-1的供氢体处理30 min；DMSO 对照组使用含DMSO 的培养基处理30 min。处理结束后，弃去旧培养液，每孔细胞用PBS 液洗涤2 次，再加入10 μmol·L-1的DCFH-DA 染料500 μL，培养箱内避光孵育30 min，弃去染液，每孔加入500 μL 的PBS，用倒置荧光显微镜观察细胞内ROS 并拍照。

1.2.5 JC-1 染色检测EA.hy926 细胞内线粒体损伤情况 按1.2.4 培养细胞24 h 后，弃去旧培养基，每孔细胞加入500 μL 的JC-1 工作液，避光孵育30 min，弃去染色液，PBS 液洗涤细胞2 次，每孔加入500 μL 的PBS 液，使用倒置荧光显微镜观察细胞内线粒体损伤情况并拍照。

1.2.6 Western blot 检测EA.hy926 细胞内GPx1、GPx4 蛋白表达 收集各组细胞，使用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，再用BCA 法检测蛋白浓度。等量蛋白质上样，10%SDS-PAGE 凝胶分离蛋白，250 V 电泳25 min，湿转法（300 mA，60 min）将蛋白转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，4 ℃一抗（GPx1 抗体以1∶100 比例稀释，GPx4 抗体以1∶1 000 比例稀释，β-Actin 抗体以1∶1 500 比例稀释）孵育过夜，TBST 液洗膜3 次后二抗室温孵育1 h，接着TBST 液洗膜3 次，加适量ECL 发光液用BIO-RAD 凝胶成像仪进行显影曝光。以β-Actin 为内参，采用Image J 软件对目的条带进行灰度值分析。目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/内参灰度值。GPx1 和GPx4蛋白下降比例=（未添加oxLDL 时目标蛋白相对表达量-添加oxLDL 后目标蛋白相对表达量）/未添加oxLDL 时目标蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组均数间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 法。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同水平硒对EA.hy926 细胞存活率的影响

显微镜下显示，未添加oxLDL 时细胞贴壁生长，边界清晰，均匀分布，数量较多；经oxLDL处理后，细胞收缩，贴壁能力下降，边界不清楚，悬浮细胞增多，细胞间隙增大，数量减少，而0.5 μmol·L-1Na2SeO3处理之后，细胞状态有所恢复。MTT 实验结果显示，在相同硒水平下，oxLDL 能降低细胞的存活率（P＜0.05）；oxLDL 氧化诱导EA.hy926 细胞后，与正常硒水平（0.05 μmol·L-1Se）相比，缺硒（0 μmol·L-1Se）不能提高oxLDL 诱导的细胞存活率（P＜0.05），而补充硒（0.5 μmol·L-1Se）能够使细胞存活率升高（P＜0.05）；未经oxLDL诱导时，与正常硒水平相比较，缺硒使细胞存活率下降（P＜0.05），见图1。

图1 不同水平硒对EA.hy926 细胞存活率的影响

2.2 不同水平硒对EA.hy926 细胞内GPx、SOD和MDA 水平的影响

相同硒水平下，oxLDL 能够诱导细胞GPx、SOD 活力降低（P 均＜0.05），MDA 含量上升；细胞经oxLDL 处理后，与正常硒水平相比，缺硒使细胞的GPx 活力下降，MDA 含量上升（P 均＜0.05），补充硒使细胞GPx 活力上升，MDA 含量下降（P 均＜0.05）；此外，细胞未经oxLDL 处理时，与正常硒水平相比，缺硒使细胞GPx、SOD 活力下降，MDA 含量升高（P 均＜0.05），补充硒使细胞GPx 活性上升（P＜0.05），见表1。

表1 不同水平硒对EA.hy926 细胞内抗氧化指标的影响（±s）

表1 不同水平硒对EA.hy926 细胞内抗氧化指标的影响（±s）

与0.05 μmol·L-1 Se 组比较*P＜0.05；与0.05 μmol·L-1 Se+ oxLDL 组比较ΔP＜0.05；与0 μmol·L-1 Se 组比较#P＜0.05；与0.5 μmol·L-1 Se 组比较$P＜0.05。

组别GPx 活力/（mU·mg-1）SOD 活力/（U·mg-1）MDA 含量/（nmol·mg-1）0 μmol·L-1 Se 组24.90±4.16*28.88±1.50*1.30±0.07*0.05 μmol·L-1 Se 组39.55±0.9131.82±2.580.53±0.13 0.5 μmol·L-1 Se 组65.65±2.01*32.09±0.130.43±0.13 0 μmol·L-1 Se+ oxLDL 组10.24±0.80Δ#25.07±0.54#1.33±0.08Δ 0.05 μmol·L-1 Se+ oxLDL 组14.74±3.54*26.26±0.81*0.78±0.08*0.5 μmol·L-1 Se+ oxLDL 组37.81±1.70Δ$26.41±0.77$0.57±0.07Δ

2.3 不同水平硒对EA.hy926 细胞内ROS 水平的影响

相同硒水平下，添加oxLDL 增加了各组细胞内ROS 水平（P＜0.05）；oxLDL 诱导细胞后，与正常硒水平相比较，缺硒使细胞内ROS 水平增加（P＜0.05），补充硒能够降低oxLDL 诱导的细胞内ROS 的产生（P＜0.05）；细胞未经oxLDL 诱导时，与正常硒水平相比较，缺硒使细胞内ROS 水平增加（P＜0.05），见图2。

图2 不同水平硒对EA.hy926 细胞内ROS 水平的影响

2.4 不同水平硒对EA.hy926 细胞线粒体损伤的影响

JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变表示线粒体膜电位下降。线粒体未受到损伤时，JC-1 染料在线粒体中聚集形成红色荧光团块；线粒体受到损伤时，JC-1 染料以单体形式在EA.hy926 细胞质中保留转变为绿色荧光。相比未添加oxLDL的EA.hy926 细胞，oxLDL 诱导的EA.hy926 细胞绿色荧光增多，红色荧光减弱，线粒体膜电位下降；且添加oxLDL 诱导细胞后，随着硒水平的增加，线粒体膜电位有上升趋势，见图3。

图3 不同水平硒对EA.hy926 细胞线粒体损伤的影响

2.5 不同水平硒对EA.hy926 细胞GPx1、GPx4蛋白表达水平的影响

Western blot 结果显示，相同硒水平下，oxLDL能够诱导细胞GPx1 和GPx4 蛋白表达水平均降低（P 均＜0.05）；细胞经oxLDL 处理后，与正常硒水平比较，缺硒使细胞GPx1 和GPx4 表达均降低（P＜均0.05），补充硒能够促进细胞GPx1 和GPx4表达（P 均＜0.05）；另外，细胞未添加oxLDL 时，随着硒浓度增加，GPx1 和GPx4 表达增加（P＜0.05）。细胞经oxLDL 诱导后，GPx1 和GPx4 蛋白表达水平均下降，且正常硒水平处理下，细胞GPx1 和GPx4蛋白的下降比例差异均有统计学意义（P 均＜0.05），见图4。

图4 不同水平硒对EA.hy926 细胞GPx1、GPx4 蛋白表达水平的影响

3 讨论

正常生理状态下，体内氧化与抗氧化水平处于动态平衡状态，当机体受到有害刺激时，体内氧化与抗氧化作用平衡紊乱，产生过多ROS，引发氧化应激，损伤血管内皮细胞[7]。低密度脂蛋白在体内被氧化修饰为oxLDL 是血管内皮细胞氧化应激的早期标志[8]。oxLDL 可诱导血管内皮细胞ROS 的产生[9]，过多的ROS 引发细胞脂质过氧化反应，产生大量MDA，加剧细胞氧化损伤的程度。此外，ROS 能够使线粒体通透性增加，膜电位下降，影响线粒体功能，导致细胞损伤[10]。GPx 和SOD 作为机体内重要的抗氧化酶，能够清除过多的ROS，抑制脂质过氧化反应，保护细胞免于氧化损伤[11]。本研究结果显示，oxLDL 诱导EA.hy926细胞后，细胞内GPx、SOD 活力下降，ROS、MDA含量升高，同时线粒体膜电位下降，与相关研究结果一致[12-13]，说明oxLDL 诱导EA.hy926 细胞发生氧化应激造成细胞损伤。

硒是人体必需的一种微量元素[14-15]，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌等多种功能[16]。硒还能促进细胞增殖，增强细胞抗氧化能力[16]，通过激活和升高GPx、SOD 水平，降低ROS 和MDA的释放来降低氧化应激，缓解氧化损伤[17]。本研究结果显示，添加0.05 μmol·L-1Se 以及补充0.5 μmol·L-1Se 均可以促进EA.hy926 细胞增殖，提高EA.hy926 细胞中GPx、SOD 活力，同时抑制ROS 和MDA 的产生，使线粒体膜电位下降，且oxLDL 诱导EA.hy926 细胞产生氧化应激后，采用0.05 μmol·L-1Se 以及0.5 μmol·L-1Se 干预，GPx和SOD 均有一定程度的恢复，同时ROS 和MDA水平有所下降，线粒体膜电位上升，说明细胞抗氧化能力依然随着硒浓度增加而增强，这与相关报道[17]结果一致。

硒在体内主要通过硒蛋白来发挥作用，已发现的硒蛋白有25 种。其中，GPx1 和GPx4 是血管内皮细胞内重要的抗氧化蛋白。GPx1 可以降解ROS，抑制细胞内过氧化氢的积累。GPx4 主要作用是清除细胞内产生的脂质过氧化物，从而发挥抗氧化作用，抵抗细胞氧化损伤[18]。Adeniran 等[19]研究表明，硒预处理使脂多糖（LPS）诱导的BEND细胞中GPx1 和GPx4 在mRNA 和蛋白水平均升高，说明硒可能通过调节BEND 细胞中GPx1 和GPx4 蛋白的表达而发挥保护作用。同样，EA.hy926细胞经oxLDL 诱导氧化应激后，GPx1 和GPx4 蛋白表达均下降，补充硒能够升高GPx1 和GPx4蛋白表达。而且，相比未发生氧化应激时，正常硒组GPx1 蛋白表达的下降程度小于GPx4 蛋白的下降程度。由此推测，GPx4 在正常硒浓度下抵抗oxLDL 诱导的氧化损伤中起重要作用。

综上所述，不同硒水平对oxLDL 诱导EA.hy926细胞的保护作用可能是不同的。补充0.5 μmol·L-1硒可同时上调硒蛋白GPx1 和GPx4 的表达，降低细胞氧化应激水平，增加EA.hy926 细胞增殖活性，使细胞免受氧化应激损伤。但是在此过程中，不同硒水平调节硒蛋白GPx1 和GPx4 表达的具体机制尚未得知，还需进行下一步深入研究。