浙江省宁波市大黄鱼病原菌分离鉴定及其耐药性分析

葛明峰，金晗，柳海，徐胜威，许昊川，王雯琼，沈伟良

（1.宁波市海洋与渔业研究院，浙江宁波 315000；2.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连 116023）

我国大黄鱼（Pseudosciaena crocea）养殖产业的发展，带动了饲料、交通运输、餐饮服务等相关上下游产业，创造了巨大的社会和经济效益。但随养殖量的攀升，受养殖密度增大，以及水体负载饱和及污染加重，管理水平低和技术规范欠科学等诸多因素影响，养殖大黄鱼病害频发，且呈日益加重趋势[1-2]。

据渔业年鉴统计，我国2020 年大黄鱼养殖产量达25.4 万t，为海水养殖鱼类第一，而因病害造成的经济损失约为5.0 亿元，其中由细菌性疾病造成的危害最为严重[3-4]。对大黄鱼细菌性病害进行监测，不仅能够较系统地掌握细菌病害的发生规律、分布及其程度等，更能及时、有效地预防与控制细菌病害，将其所造成的损失降到最低[5]。

同时，为推进农业农村部关于实施2021 年水产绿色健康养殖“五大行动”，达到用药减量的目的，对分离的病原菌进行了药敏试验，以掌握其对不同渔药的耐药性及其变化规律，丰富当地及全国大黄鱼养殖区域病原菌耐药谱库，为科学、规范、精准、合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 检测样品

2021 年4—10 月，每月在象山西沪港、三门湾大黄鱼网箱养殖海区进行1 次例行采样检测，并同时对宁波市其他大黄鱼养殖场，如发生细菌性疾病的场进行应急采样检测。每次每个养殖点现场采集临床症状明显的活体或濒临死亡的个体5～10 尾，共采集大黄鱼93 尾。

1.2 主要试剂与材料

牛脑心浸出液固体培养基，青岛海博生物技术有限公司产品；DNA 提取试剂盒，Omega Biotek 公司产品；2×TaqMasterMix（含染料），Takara Bio 公司产品；16S rDNA 引物，由北京华大基因科技有限公司合成；药敏检测分析试剂盒、试剂板，南京菲恩医疗科技有限公司产品。

1.3 细菌分离与鉴定

无菌条件下，取鱼肝、脾、肾等组织划线接种于牛脑心浸出液固体平板，28 ℃培养24～48 h（鰤鱼诺卡氏菌需培养5～7 d）；挑取单菌落纯化培养后，提取细菌DNA。根据16S rDNA 序列设计引物，建立PCR 扩增体系[6]。PCR 产物测序结果由北京六合华大基因科技股份有限公司提供，经GenBank Blast 数据比对后进行细菌鉴定。

1.4 药敏试验

根据全国水产技术推广总站关于水产养殖主要病原微生物耐药性普查工作要求，选定硫酸新霉素、盐酸多西环素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶、“磺胺甲噁唑+甲氧苄啶”等8 种抗菌药物。根据药敏检测分析试剂盒、试剂板操作说明，得到各药物对菌株的最低抑菌质量浓度（MIC），计算中位值MIC50，然后进行分析比较。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

2.1.1 细菌种类 2021 年1—10 月从采集的93 尾大黄鱼中分离到6 种细菌，共25株（表1）。其中：杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）8株，占总菌株数的32%（8/25）；三类弧菌10株，包括溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）各4株，副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）2株，占总分离菌数的40%（10/25）；另有5株鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）和2株美人鱼发光杆菌（Photobacterium），占比分别为20%（5/25）和8%（2/25）。这25株菌株从象山地区分离到20株（西沪港13株、三门湾7株），鄞州和奉化地区各分离到2株，宁海分离到1株。

表1 2021 年1—10 月分离到的细菌种类及数量 单位：株

2.1.2 分离地点与时间 共分离到杀香鱼假单胞菌8株，其中1 月（水温21 ℃）于鄞州区室内水泥池发病大黄鱼上分离到2株，4—5 月在象山网箱养殖大黄鱼上陆续分离到6株（4 月、5 月西沪港各2株，三门湾各1株），发病水温普遍为18～22 ℃。分离到弧菌10株（奉化、象山西沪港、三门湾分别2株、5株、3株），其中溶藻弧菌4株、哈维氏弧菌4株、副溶血弧菌2株，且采样时间集中在5、7、8 月。5 月，从象山西沪港同一批鱼组织上不仅分离到1株溶藻弧菌，同时还分离到2株美人鱼发光杆菌，表现为混合感染。8—10 月，共分离到5株鰤鱼诺卡氏菌，其中8—9 月从宁海、象山地区各分离到2株，10 月从象山西沪港分离到1株。

2.2 细菌耐药性分析

2.2.1 不同病原菌对药物的耐药性 通过统计MIC50得到的结果见表2。分析可知，杀香鱼假单胞菌的耐药性普遍大于其他5 种细菌，特别是对酰胺醇类（甲砜霉素、氟苯尼考）及磺胺类药物（磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶）的MIC50高于其他病原菌。3 种弧菌对不同药物的耐药性基本一致，除对恩诺沙星和甲砜霉素略有差异外，对其他6 种药物的MIC50则完全相同，且与其他3 种病原菌相比，弧菌对药物的敏感性更强。美人鱼发光杆菌和鰤鱼诺卡氏菌都对盐酸多西环素最为敏感，与3 种弧菌的耐药性类似。从抗菌药物种类分析，2 种磺胺类药物对不同病原菌的抑制作用较强（杀香鱼假单胞菌除外），盐酸多西环素和氟甲喹对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌及鰤鱼诺卡氏菌都有极好的抑制作用，除氟甲喹对美人鱼发光杆菌MIC50为4.00 mg/L 外，这两种药物对5 种菌的MIC50均小于最低试验药物质量浓度。另外，恩诺沙星、硫酸新霉素的抑菌效果也普遍较好，MIC50为0.13～4.00 mg/L；而酰胺醇类的甲砜霉素、氟苯尼考抑菌效果一般，尤其是对杀香鱼假单胞菌的MIC50≥200 mg/L。

表2 各病原菌对不同药物的耐药性（MIC50） 单位：mg/L

2.2.2 同种病原菌对药物的耐药性 对不同采样时间、不同养殖地区大黄鱼上分离到的杀香鱼假单胞菌进行药敏试验，结果发现各菌株对同一药物的耐药性并不完全一致（表3）。除了磺胺间甲氧嘧啶和“磺胺甲噁唑+甲氧苄啶”这2 种药物对4株病原菌的MIC 相同外，其他6 种药物对不同时间分离到的杀香鱼假单胞菌的抑菌效果均有一定差异。其中，5 月16 日从象山三门湾分离的菌株对氟甲喹的敏感性高于其他株菌；1 月15 日从鄞州室内水泥池养殖大黄鱼上分到的菌株对恩诺沙星敏感性高于其他株菌。总体而言，4 月2 日从象山西沪港网箱养殖鱼体上分离到的杀香鱼假单胞菌对8种药物的耐受性普遍高于其他3 个菌株。这表明从不同时间、不同地区、不同养殖模式大黄鱼上分离到的杀香鱼假单胞菌对药物的耐药性存在一定差异。

表3 不同时间分离到的杀香鱼假单胞菌对不同药物的耐药性（MIC50） 单位：mg/L

3 讨论

细菌病一直是困扰大黄鱼健康养殖的一类疾病，其中以弧菌病（皮肤溃疡病）居多，危害最大[7]。李清禄等[8]对引起福建省网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌鉴定为鳗弧菌和副溶血弧菌，且鳗弧菌占51%。这与本研究结果有一定差异，本研究未分离到鳗弧菌，这可能跟福建省区域的水温、盐度较宁波市高等环境差异导致水体中优势菌群不同有关。杀香鱼假单胞菌是引起宁波市大黄鱼内脏白点病的主要病原[9-10]。有研究[11-13]对宁德市大黄鱼内脏白点病进行了流行病学调查，发现致病菌也为假单胞菌属细菌。本次调查发现，从象山西沪港鱼体上分离到的菌株数及细菌种类均高于三门湾。这可能跟两者所处地理位置有关，三门湾更靠近象山港口，水流速度快，且该区域养殖密度低，养殖环境整体优于西沪港，因而细菌感染及疾病的发生都较后者低。

大黄鱼细菌病流行时间大多在4—10 月，其中5—9 月为流行高峰期[7]。从不同病原菌的分离时间分析，4—5 月是大黄鱼内脏白点病的高发期，随着水温升高，该病有所缓减。5—8 月由于梅雨、高温等恶劣天气影响，且随着水温上升，细菌迅速繁殖，水质加剧恶化，易发生弧菌病等多种细菌疾病。如这一时期分离到的美人鱼发光杆菌和3 种弧菌，都是海水中常见的条件致病菌[14-15]，其感染鱼体的主要原因是目前网箱养殖集约化程度高，养殖密度大，导致鱼体容易损伤，免疫力下降。本次调查在6 月未分离到任何菌株，推测可能跟5 月细菌集中感染后养殖户注重水体消毒并内服抗生素等积极的防控措施有关，亦或跟采样点的局限性有关。8—10 月为大黄鱼诺卡氏菌病发病高峰期，该菌从2006 年在网箱养殖大黄鱼被发现后[16-17]，便一直危害鱼体，尤其近几年对宁波市大黄鱼养殖造成了较为严重影响，虽然日死亡量不大，但影响时间长。由上述分析可知，大黄鱼细菌性疾病的发生种类与水温存在一定的相关性。另有研究[18]表明，福建省等大黄鱼养殖地区也时常发生上述疾病，但流行时间略有差异，如内脏白点病在宁德市的发病期往往为11 月至次年5 月，而宁波市11 月至次年2 月很少发现该病。这主要跟水温有关，该时期宁波市水温较低，养殖户往往将大黄鱼运往温州、福建等水温较高的地区越冬。

从细菌耐药性结果可知，盐酸多西环素、氟甲喹、恩诺沙星对大部分病原菌的抑制效果较好，可作为防治大黄鱼细菌病的首选药物。但考虑到宁波市养殖区域盐酸多西环素及恩诺沙星使用较普遍且频繁，建议养殖户可用氟甲喹替代，实行轮换用药，以避免细菌产生耐药性[19]。磺胺类药物与增效剂甲氧苄啶合用疗效更佳[5]。病原菌对磺胺类药物的MIC50较前几年大幅下降，这可能是由于近几年宁波市大黄鱼养殖区域较少使用磺胺类药物，亦或与菌株耐药性的自然消失有关，但对该类药物敏感性还需持续跟踪监测，以准确掌握其变化规律。另外，不同时间、不同地区鱼体上分离到的杀香鱼假单胞菌对药物的耐药性并非完全一致，这可能跟菌种存在不同亚种以及各养殖地区用药状况有关。因此即使针对同种细菌，在药物选择及剂量上也应参考药敏试验结果而定，不可仅凭经验或照搬书本[20]。但要指出的是，MIC50虽然是评价病原菌对抗菌药物敏感性的主要指标，是选择有效抗菌药物的重要依据，但体外试验与鱼体内环境还存在一定差异。因此，要制订有效的治疗方案，达到最佳的疗效，还应结合药代动力学、药效学等参数。

病原菌耐药性监测对科学精准用药，推动水产绿色健康养殖及用药减量具有十分重要的意义。之前关于大黄鱼细菌耐药性的分析大多集中于福建省宁德市[21-22]，而本研究进一步丰富了大黄鱼病原菌耐药性的基础数据，扩大了耐药性谱库，有利于在相关疾病发生时做出快速判断并采用相应的药物进行防控，避免乱用、滥用药物，从而降低病原微生物耐药性。同时，养殖户还应严格遵守《水产养殖用药明白纸》（2020 年1、2 号）相关规定，并严格执行休药期制度，避免鱼体药物残留超标，保障水产品质量安全。