猪流行性腹泻病毒山东SD20BZ01株的分离鉴定及遗传进化分析

田似报，尹明荣，王文文，厉磊，王一新，李阳

（1.北京中科基因技术股份有限公司，北京 102600；2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；3.临沂市畜牧发展促进中心，山东临沂 276003；4.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种急性、病毒性肠道传染病[1]。该病的临床症状主要为腹泻、脱水和呕吐，尤其以哺乳仔猪发病最为严重，10 日龄内哺乳仔猪死亡率可高达90%。该病于1971 年首次在英国被报道，我国最早于1984 年分离到PEDV 毒株[2-3]。此后，由于PEDV 疫苗的广泛使用，该病得到有效控制。然而，自2010 年以来，PED在我国再次大面积暴发，给我国养猪业带来了巨大经济损失[4-6]。

PEDV 属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA 病毒。由于RNA 聚合酶缺乏修正功能，PEDV 在复制过程中发生变异的概率相对较高。研究[7]发现，2010 年以来我国PED 再次流行与变异株的出现有关，经典疫苗株对其保护效果减弱，从而造成PEDV 的广泛传播。基于对全基因组序列的遗传进化分析，PEDV 可被分为GI 和GII 两个基因型。其中，GI 群是以CV777株为主的经典毒株，GII 群为近几年流行的变异毒株，又可进一步被分为GII-a 亚群和GII-b 亚群[8]。因此，了解并掌握不同地区PEDV 毒株变异情况，对于PED 的针对性防控具有重要意义。

本试验采用细胞接种方法，从2020 年山东省滨州市某猪场的PEDV 阳性样品中成功分离到1株PEDV 毒株，并将其命名为SD20BZ01株。随后，本研究对SD20BZ01株进行了全基因组测序，并通过DNAstar、MEGA 7.0 等软件，将其与参考毒株序列进行同源性比对和遗传进化分析，以期了解该地区流行毒株的变异趋势，从而为科学有效防控PED 流行提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2020 年1 月，山东省滨州市某猪场暴发腹泻疫情。发病猪表现消瘦、精神萎靡，排黄色水样粪便。剖检可见小肠肠管膨胀扩张，肠壁变薄（图1-A），肠系膜淋巴结肿胀出血（图1-B）。采用胶体金抗原快速检测试剂盒（广州悦洋）进行检测，初步判定为PEDV 阳性。采集发病猪的肠道组织和粪便样品，置于-80 ℃冻存。

1.2 主要试剂

高糖DMEM 培养基、胎牛血清，购自以色列BI 公司；病毒RNA 提取试剂盒，购自OMEGA公司；PrimeScript ™ One Step RT-PCR Kit、pMD18-T载体连接试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒，购自北京诺贝莱生物科技有限公司；Trans 5 000 DNA Marker，均购自北京全式金生物技术有限公司；FITC 标记的羊抗鼠IgG，购自美国Sigma 公司；鼠抗PEDV N 蛋白多克隆抗体，由山东农业大学动物检疫与食品检验研究室制备、保存。

1.3 PEDV 分离与鉴定

将发病猪肠道组织和肠内容物研磨，用0.22 μm 滤器过滤除菌，接种至单层生长的Vero E6细胞，同时在培养基中添加20 μg/mL 的胰蛋白酶，置于含有5% CO2的37 ℃温箱孵育2 h。孵育结束后更换新鲜的DMEM 培养基（含20 μg/mL 胰酶），继续置于温箱培养，每隔一段时间观察是否出现细胞病变。若72 h 后仍未出现病变，则继续盲传细胞。待出现明显细胞病变后，收集细胞样品反复冻融3次后，1 500×g离心15 min，收集上清作为病毒液置于-80 ℃保存。

1.4 间接免疫荧光试验（indirect immunoinfluscent assay，IFA）

将Vero E6 细胞传代，细胞长满后加入PEDV毒株。待细胞出现明显病变后，使用PBS 轻柔清洗细胞板2 遍，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3 遍，以鼠抗PEDV N 蛋白多克隆抗体为一抗，4 ℃孵育过夜。随后，用PBS 清洗3 遍，加入FITC 标记的羊抗鼠lgG 抗体，37 ℃孵育2 h；最后，经PBS 清洗3 遍，在荧光显微镜下观察试验结果。

1.5 PEDV 全基因组序列测定

提取病毒RNA，利用逆转录试剂制备cDNA。根据文献[9]，使用15 对特异性引物进行RT-PCR 扩增。随后，将扩增产物胶回收，将纯化产物连接pMD18-T 载体，转化到DH5α 感受态细胞，并将阳性菌液送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

1.6 SD20BZ01株遗传进化分析

从GeneBank 下载29株国内外具有代表性的PEDV 毒株全基因组序列（表1），与本研究所分离的SD20BZ01株全基因组序列进行比对。利用MEGA 7.0 软件，采用邻接法（Neighbor-Joining method）对PEDV 全基因序列和S基因序列进行进化分析，同时使用DNAstar 软件MegAIign 程序中的Clustal W 算法对序列同源性的进行计算。

表1 本研究所选用PEDV 参考毒株信息

2 结果

2.1 病毒分离与鉴定

将病料研磨过滤，接种Vero E6 细胞后传代培养，在第三代逐渐出现典型的细胞病变，主要表现为细胞皱缩变圆、聚集成团、形成合胞体；随着感染时间增加，细胞病变面积变大，并且出现脱落现象，形成空泡（图2-A、B）。将病毒重新接种Vero E6 细胞，感染36 h 后，以鼠抗PEDV N 蛋白多克隆抗体为一抗，通过IFA 进行检测。结果（图2-C、D）显示，被感染细胞发出绿色荧光，而对照组细胞未见明显CPE 和荧光信号，证实成功分离到1株PEDV，将其命名为SD20BZ01株。

2.2 SD20BZ01株基因组结构分析

参考文献[9]报道，合成15 对特异性引物，对SD20BZ01株基因组进行分段扩增，成功扩增出符合预期的片段。将扩增产物进行测序，经拼接后获得SD20BZ01株全基因组序列。PEDV SD20BZ01株全基因组序列长度为28 038 bp，病毒基因组结构为5′UTR-ORF1a/ORF1b-S-ORF3-E-MN-3′UTR。对PEDV 不同毒株编码区所包含的氨基酸数目进行比较发现，SD20BZ01株的M、N、E基因较为保守，序列大小与参考株基本一致（表2）。

表2 PEDV SD20BZ01株各基因结构分析结果

2.3 SD20BZ01株全基因组同源性与遗传进化分析

SD20BZ01株全基因组序列与其他29株参考毒株全基因组序列的核苷酸同源性为96.4%～98.8%，与2014 年分离自德国的L00721-GER-2014 毒株同源性最高，为98.8%，与1998 年分离自韩国的SM98-South Korea毒株同源性最低，为96.4%。SD20BZ01株与我国2010 年以来流行的GII-b 亚群变异株序列同源性为97.8%～98.7%，与CV777、DR13、SM98、SD-M 等经典毒株同源性为95.4%～96.6%。利用 MEGA 7.0 软件构建系统发育进化树，分析其遗传进化规律。分析结果显示，SD20BZ01 与GII-b 亚群CH-SCZY44-2017、ZL29等毒株的进化距离较近，而与GI 群的经典毒株进化距离较远，该结果与同源性分析结果基本一致（图3）。因此，SD20BZ01株属于近年来流行的GII-b亚群变异型毒株。

2.4 SD20BZ01株S 基因同源性与遗传进化分析

SD20BZ01株S基因全长4161bp，编码1386 个氨基酸。与疫苗株CV777 相比，S基因存在16 处碱基插入和10 处碱基缺失，同时伴有大量碱基突变。缺失位点具体为，S基因第163～164 位（CV777）插 入TTG，第173～174 位插 入GGGTGTTAA，第193～194位插入G，第402～403 位插入GAT；插入位点具体为，在第217～218 位（SD20BZ01）缺失A，第479～480 位缺失TGGAAA。其推导的氨基酸在第58～59 位插入QGVN，第139～140 位插入N；第162～163 位缺失DI。同疫苗株CV777 相比，SD20BZ01 在核心表位（core neutralizing epitope，COE）结构域（499～638 位氨基酸区域）存在氨基酸变异，分别 是A517S、L521S、S523G、V527L、T594S、A605E、G594S、A705D、L612F、I635V。运 用DNAstar 软件对SD20BZ01株S基因的抗原指数进行分析，发现SD20BZ01株S 蛋白和CV777株S蛋白抗原性基本一致，差别主要集中在20～100 及300～350 氨基酸位置。

SD20BZ01株S基因与其余29株PEDV 参考株S基因的核苷酸同源性为92.9%～98.8%，与2016 年分离自美国的PC177 毒株同源性最高，为98.8%；而与SD-M 毒株同源性最低，为92.9%。SD20BZ01株S基因与我国2010 年以来流行的GII-b 亚群变异株核苷酸同源性为96.7%～98.7%，与CV777、DR13、SM98、SD-M 等经典毒株同源性为93.9%～94.2%。基于S基因序列的进化树显示，SD20BZ01株与我国近年来分离的变异株位于同一进化枝，与CV777 等经典毒株所属的GI 群存在显著的分支差异（图4）。上述结果表明，SD20BZ01株与近年来国内外流行的GII-b 亚群PEDV 变异株亲缘关系较近，与早期经典毒株亲缘关系较远。与经典株CV777 相比，SD20BZ01株S基因虽然发生了一定突变，但与近年来流行的GII-b 亚群PEDV 变异株序列基本一致。

3 讨论

PED的流行给我国养猪业造成重大经济损失，疫苗免疫是防控该病的主要方式。目前，已经开发了几种PEDV 疫苗，例如CV777 减毒或灭活疫苗以及活病毒疫苗83P-5、SM98-1和DR13[10]。在我国，TGEV 和PEDV 二联弱毒苗和灭活苗的使用降低了PEDV 对养猪业带来的损失。然而，2010 年以来，PEDV 再次流行，疫苗免疫无法达到理想保护效果[7，11-12]。一般认为，PEDV 属于单股正链RNA病毒，其RNA 酶缺乏校正功能，因此RNA 病毒容易发生变异。此次PEDV 流行株的S基因发生了变异，引起抗原表位发生改变，从而导致疫苗保护效果不佳。因此，掌握各地区当前PEDV 流行毒株变异情况，制备特异性疫苗成为防控PEDV持续传播的关键。

为了解山东省PEDV 流行株的分子特征及遗传进化规律，本研究对山东省滨州市某猪场进行了PEDV 流行株分离鉴定和测序分析。病毒分离鉴定是疾病诊断的金标准，也是动物病毒生物学特性研究的基础。目前，对于PEDV 的分离培养，一般认为在Vero E6 细胞或IPEC-J2 细胞上可成功获得PEDV 细胞适应株。本研究使用Vero E6 细胞在病料中分离到一株PEDV。该毒株可使Vero E6 细胞产生典型的细胞病变，且随着传代次数增多，病变时间变早。使用特异性引物进行RT-PCR 检测，可扩增出目的条带，证实成功分离到PEDV 毒株，将其命名为SD20BZ01。

随后，本研究通过RT-PCR 进行全基因序列的分段扩增，并进行测序和序列分析。分析结果显示，SD20BZ01 与GII-b 亚群变异株同源性最高，且位于进化树的同一分支上，表明SD20BZ01 为GII-b亚群PEDV。PEDV 为冠状病毒科冠状病毒属、有囊膜的单股正链RNA 病毒，基因组全长约28 kb，编码4 个结构蛋白（S、M、E、N 蛋白）、15 个非结构蛋白（NSP1—NSP15）和ORF3[13]。其中S 蛋白位于病毒衣壳外侧，主要作用是识别并结合细胞特异性受体，启动病毒感染过程，其变异程度较高，且与PEDV 的毒力和遗传关系密切[14]。一般认为，PEDV S 蛋白的499～638 位氨基酸是一个关键的中和表位，并将其命名为COE 区。本研究对SD20BZ01 的S基因序列进行了比对和分析。结果显示，与CV777株相比，SD20BZ01 的S蛋白发生了多处突变、缺失和插入事件，而这些改变与近年来我国PEDV 变异株基因序列基本一致，提示GII-b 亚群PEDV 变异规律逐渐趋于稳定[9，12，15-16]。与CV777株相比，SD20BZ01株 在中和抗原表位COE 区有10 个氨基酸发生突变，这些突变可能会影响免疫原性，从而导致疫苗免疫失败，造成PED 暴发。

综上所述，本研究分离的SD20BZ01株为PEDV GII-b 亚群毒株，其基因序列与近年来我国流行的PEDV 变异株突变情况基本一致。对其全基因组序列进行比对分析，对于深入了解山东省PEDV 流行状况，有针对性设计疫苗，以及科学防控PED 传播具有重要意义。