禽网状内皮组织增生症病毒山东SD2101株的分离鉴定及全基因组序列和致病性分析

桑 淼，盖小君，刘玲，尹明荣，张传强，李玉燕，郭龙宗，王一新

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.烟台市动物疫病预防与控制中心，山东烟台 264003；3.昌邑市畜牧业发展中心，山东昌邑 261300；4.山东益生种畜禽股份有限公司，山东烟台 265509）

禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）是一种致瘤性反转录病毒，可感染鸡、鸭、火鸡等禽类，引起以网状细胞增生以及淋巴组织和其他组织慢性肿瘤为主要特征的网状内皮组织增生症（reticuloendotheliosis，RE）。REV 不仅可以诱发肿瘤，还可以造成感染禽生长迟缓和严重的免疫抑制，从而继发其他病原感染，导致禽群淘汰率和死亡率升高，给养禽业带来巨大经济损失[1]。该病既可以通过水平接触传播，也可以通过种源垂直传播[2]。此外，使用污染了REV 的禽用弱毒疫苗也是该病的重要传播方式之一[3-5]。

REV 的前病毒基因组序列全长8.0～9.0 kb，包含gag、pol和env3 个基因以及两端完全一致的长末端非编码序列（long terminal repeat，LTR）。1957 年，第1株REV T株从1 只患有内脏淋巴瘤的火鸡中被分离出来。在我国，何宏虎等[6]1986年首次分离出1株REV-C45株。之后，山东、江苏等地也多次分离到REV[7-8]。近年来，我国鸡群中的REV 血清抗体阳性率逐渐增高，特别是在地方品系鸡中尤为明显[9]。流行病学调查研究[10-12]显示，REV 与其他免疫抑制病毒，如马立克氏病毒（Marek′s disease virus，MDV）、禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）以及鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）混合感染越来越普遍，严重威胁家禽业的可持续发展。

尽管已有文献[13-16]报道在我国不同地区、不同类型的鸡群中分离到REV，但对分离株致病性的研究相对较少。2021 年，本课题组在山东省某疑似发病白羽肉种鸡群中分离到1株REV野毒株，并将其命名为SD2101株，随后对病毒全基因组序列进行了测序和遗传进化分析，并通过动物试验研究了其致病性。

1 材料方法

1.1 样品来源

山东省某父母代白羽肉种鸡场鸡群在100 日龄左右出现生长迟缓、精神萎靡现象，但死亡率较低，剖检未发现肝脏和脾脏等部位出现明显的肿瘤结节。血清学检测显示，该鸡群REV 抗体阳性率为36.40%，而J 亚群ALV、AB 亚群ALV 等免疫抑制性病原抗体检测结果均为阴性，初步怀疑该鸡群发生REV 感染。无菌采集疑似感染鸡抗凝血，1 200 r/min离心5 min后，取血浆冻存于-80 ℃备用。

1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒、DNA 片段纯化回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒，均购自北京诺贝莱生物科技有限公司；REV 特异性单克隆抗体11B118，由山东农业大学崔治中教授惠赠[17]；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗鼠IgG 抗体，购自Sigma公司；大肠杆菌DH5α 感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；pMD-18T 载体，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 病毒分离鉴定

将DF-1 细胞接种于6 孔培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；待细胞铺满汇合至80%左右时，每孔接种150 μL 疑似感染鸡血浆，37 ℃吸附2 h 后，换为含2%胎牛血清的DMEM 细胞培养液，培养7 d 后盲传。传代时预先在细胞培养板中放置无菌细胞爬片，7 d 后收集细胞爬片并用预冷的丙酮-乙醇固定液（V:V=3:2）固定；将REV特异性单克隆抗体11B118 加到细胞爬片上，置于37 ℃温箱中作用45 min；弃去单抗后用PBS 洗涤3 次，然后加入100 μL FITC 标记的羊抗鼠IgG 抗体，置于37 ℃温箱中作用45 min；弃去单抗后用PBS 洗涤3 次，在荧光显微镜下观察。为排除所分离毒株可能含有其他病毒污染，通过PCR 或者RT-PCR，对ALV、MDV、禽呼肠孤病毒（avian reovirus，REO）和禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）进行检测。所用引物序列如表1 所示。

1.4 分离毒株全基因组克隆测序

根据GenBank 下载的REV 参考株序列合成6对引物，通过PCR 分段扩增REV 全基因组，所用引物序列见表1。使用DNA 提取试剂盒提取感染了REV 的DF-1 基因组DNA，进行PCR 扩增。扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，rTaqDNA聚合酶0.5μL，ddH2O 14.0 μL，总体积为25.0 μL。PCR扩增条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃1 min，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，共30个循环；复延伸72 ℃ 10 min。将PCR 产物经凝胶回收纯化后与pMD-18T 载体连接，转化DH5α 大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

表1 本研究所用引物序列信息

1.5 分离毒株前病毒基因组拼接和序列分析

从GenBank 下载33株国内外REV 毒株全基因组序列，与本研究所分离的SD2101 毒株全基因组序列、LTR 序列和env基因进行比对。利用MEGA 7.0 软件，采用邻接法（Neighbor-Joining method），对REV 全基因和分段基因进行系统进化树分析。同时使用DNAstar 软件MegAIign 程序中的clustal W 算法，计算序列同源性。本研究所选用REV 参考毒株信息见表2。

表2 本研究所选用REV 参考毒株信息

1.6 SD2101株致病性试验

将50 只1 日龄 SPF 雏鸡随机分为2 组，每组 25 只，分别标记为攻毒组和对照组。其中：攻毒组的25 只SPF 雏鸡，于1 日龄采用腹腔注射接种REV SD2101株，每只鸡接种1 000 TCID50；对照组的雏鸡，接种相同体积的DMEM 培养液。接种后1～6 周内，每周测定鸡的体质量，并分别于接种后第3、4、5 周，每组随机挑选5 只进行剖杀，计算免疫器官（脾脏、法氏囊、胸腺）指数。免疫器官指数=器官质量（mg）/体质量（g）。为分析REV 对鸡体液免疫的抑制作用，所有鸡在接种后第1 周，经颈部皮下免疫NDV 灭活疫苗和AIV-H9 灭活疫苗，并分别于第3、4、5 周采集鸡血清，通过血凝-血凝抑制试验测定NDV 和AIV-H9 的抗体滴度。

2 结果与分析

2.1 病毒分离与鉴定

采集疑似患病鸡抗凝血，分离血浆并接种于DF-1 细胞；盲传1 代后，使用REV 特异性单抗11B118 进行IFA 检测。结果显示，试验组的DF-1 细胞浆呈现绿色阳性荧光染色（图1-A），证实在患病鸡中分离到1株REV，将其命名为SD2101，而对照组DF-1 细胞浆中未见绿色荧光（图1-B）。PCR 及RT-PCR 检测结果显示，样品中不含ALV、MDV、REO 及FAdV 等其他病毒。

2.2 SD2101株全基因组序列测定与拼接

以感染SD2101 毒株的DF-1 细胞基因组DNA为模板，使用6 对引物进行病毒基因组扩增，并将目的片段进行克隆、测序，使用DNAstar 软件对测序结果进行拼接，获得了SD2101株的前病毒全基因组核苷酸序列。SD2101 毒株前病毒全基因序列全长8 284 bp，具有典型的复制完全型逆转录病毒的基因组结构，包含gag、pol、env3 个主要基因，两端为完全一致的LTR 序列，基因组序列中不包含肿瘤基因。其中：gag基因位于934～2 433（1 500 bp），pol基因位 于2 434～6 015（3 582 bp），env基因位于5 952～7 712（1 761 bp）。两端长末端重复序列LTR 长度为543 bp，分别位于基因组的1～543及7 742～8 284；LTR 由U3、R、U5 三部分组成，长度分别为363 bp（1～363、7 742～8 104）、78 bp（364～441、8 105～8 182）、102 bp（442～543、8 183～8 284）。该毒株序列已上传GenBank，登录号为OM864267。

2.3 SD2101株序列变异与进化分析

使用DNAstar 软件，对SD2101株前病毒全基因组序列与33株REV 参考株的全基因组核苷酸序列进行同源性比对。结果显示：SD2101 全基因组与其他参考株序列同源性为95.4%～99.6%，与国内分离株HA1101、HLJR0901，以及我国台湾地区分离株3337-05、3410-06 同源性最高（99.6%），但与GD1210（95.5%）和SNV（95.4%）同源性相对较低。基于全基因组序列的遗传进化规律与同源性关系基本一致，所有REV 毒株被划分为两个分支，SD2101株处于第一个大的遗传进化分支上，而IBDV 弱毒疫苗污染株IBD-C1605、美国鸭源分离株SNV、我国鸡源分离株GD1210 和SDAUR-S1 处于另一个进化分支上（图2）。

编码区核苷酸序列同源性分析显示：不同REV 毒株的gag、pol和env3 个编码序列较为保守，均未出现较大变异。其中，SD2101株gag基因核苷酸序列与参考株同源性为96.5%～99.5%，pol基因核苷酸序列与参考株同源性为96.4%～99.7%，与REV 诱导宿主产生中和抗体密切相关的env基因也较为保守，核苷酸序列与参考株同源性为95.8%～99.7%。基于env基因的遗传进化树与基于全基因组序列的进化树关系基本一致，HB2101 毒株与大部分毒株处于一个进化支，而LN1201、IBD-C1605、SNV、GD1210 和SDAUR-S1 处于单独进化分支（图3）。

LTR 区域核苷酸序列同源性分析显示：SD2101株LTR 与参考株同源性为87.1%～99.4%。在LTR 序列中，U3 区变异程度最大，而R 区和U5 区高度保守。SD2101株的U3 区与不同参考株的同源性为82.9%～99.4%，与SNV株、SDAUR-S1株和LN1201株等同源性较低，而与HA1101、HLJR0901 和SY1209 等国内分离株的同源性较高。根据LTR 构建的系统进化树显示，SD2101株与大部分国内分离株处于同一进化支，而SNV株、SDAUR-S1株和LN1201株等处于独立进化支（图4）。

2.4 SD2101株致病性试验

将SD2101 腹腔注射接种1 日龄SPF 鸡。在整个试验周期中，感染鸡采食均正常，未出现死亡，部分感染鸡羽毛蓬松、精神不佳。每周称量鸡的体质量，结果发现在接种后2～6 周内，感染组生长缓慢，与对照组相比差异显著（P＜0.05，图5-A）。免疫器官指数计算结果（图5-B）显示，在这3 个时间点，感染组脾脏均出现肿大（差异不明显），而法氏囊和胸腺均出现不同程度的萎缩（P＜0.05，图5-C、D）。NDV 和AIV-H9 的抗体滴度检测结果（图5-E、F）显示，在疫苗免疫后的2～4 周，REV 感染均可显著降低NDV 和AIV-H9 的抗体滴度（P＜0.05），且REV 感染对NDV 滴度的影响大于对AIV-H9 的影响。

3 讨论

REV 不仅可以诱发禽的肿瘤性疾病，而且可以导致禽免疫抑制，降低其他疫病的疫苗免疫效果[1]。血清流行病学调查结果[9]显示，近年来我国各地REV 感染日益严重，在地方品系鸡群中阳性率高达80%以上。然而，目前关于REV 分离鉴定和基因组分析的报道仍然有限，全国范围内的流行病学数据相对匮乏[13-16]。这可能与人们将目光重点集中于ALV、MDV 等免疫抑制性疾病有关，在一定程度上忽视了对REV 的鉴定。本研究从出现生长迟缓和免疫抑制的父母代肉种鸡场分离鉴定到1株REV，提示有必要提高对于REV 诱发疾病的重视程度。

对本研究中分离到的SD2101株全基因组序列进行了测序，并将其与GenBank 上下载的参考株序列进行比对，结果发现SD2101株全基因组序列与2011 年江苏省某鸡群分离到的HA1101株同源性最高，而与美国经典株SNV 同源性相对较低。基于全基因组的遗传进化树分析与同源性比对结果基本一致，即SD2101 与大部分国内分离株处于同一进化支，而美国经典株SNV、广东鸡群分离株GD1210 和IBDV 弱毒疫苗污染株C1605 处于另一单独进化分支，表明REV 分离株遗传进化关系与地域和分离时间关系不大。但总体上，不同REV毒株之间的差异性不大。事实上，即使与REV 诱导宿主产生中和抗体密切相关的env基因也较为保守，这与同为反转录病毒的ALV 差别较大。相对来讲，LTR 区特别是U3 区是REV 差异最大，也是最容易发生变异的区域。LTR 区域在REV 基因组中发挥启动子功能。该区域的插入或突变对于病毒的致病性具有一定影响[15]。本研究中，SD2101株的LTR 区域与经典的REV-A株和最近分离的国内鸡源BJ1503株最为接近，这可能是不同REV 毒株之间发生基因重组的结果。

为了解SD2101株的致病性，选取了1 日龄SPF 雏鸡，通过腹腔注射方式接种病毒，并对体质量、免疫器官指数和对疫苗免疫应答等几个指标进行了测定，结果发现REV SD2101株造成了1 日龄SPF 鸡发育迟缓和免疫器官发育异常，特别是胸腺和法氏囊出现了明显萎缩，这与临床上观察到的自然感染鸡群症状基本一致。此外，SD2101株感染还可以显著抑制鸡群对NDV 和AIV-H9 灭活疫苗免疫后的免疫反应，并且对NDV 的抑制作用更加明显。然而，在剖检过程中，并未发现感染鸡群明显的病理变化和肿瘤发生，这可能是与试验周期较短有关，一般认为REV 肿瘤的诱发需要15 周以上的时间。

总体上，本研究完善了我国REV 的流行病学资料，提示应重视对该病的检测和防控，特别是控制其早期感染和垂直传播，否则不仅会影响鸡群生产性能，而且其诱发的免疫抑制还会对其他重大动物疫病防控产生潜在威胁。