金芪降糖片治疗2型糖尿病大鼠的血清代谢组学研究

时正媛 李京峰 宝丽 杨春静 续茜桥 杨璐

摘要 目的：本研究采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，探讨了金芪降糖片（JQJT）治疗2型糖尿病（T2DM）的作用机制。方法：采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM模型，检测大鼠体质量、血糖等指标。利用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析对照组、模型组、阳性药组、正常给中药组、模型给中药组大鼠的血清样品代谢谱。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对差异代谢物进行筛选和鉴别。结果：从血清中筛选出15个潜在的生物标志物，并利用Met PA构建了1条相关的代谢通路，即甘油磷脂代谢通路。在2型糖尿病（T2DM）大鼠血清中，溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）（18∶0）和LysoPC（16∶1）等9种代谢物下调，LysoPC（18∶1）和LysoPC（20∶0）等6种代谢物上调。结论：金芪降糖片给药组能使这15种潜在的生物标志物有良好的回调趋势，推测金芪降糖片可能通过调节脂代谢紊乱而缓解T2DM的进程。

关键词 金芪降糖片;2型糖尿病;代谢组学;超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱;血清;中药;甘油磷脂代谢;生物标志物

Serum Metabolomics of Jinqi Jiangtang Tablets in Rats with Type 2 Diabetes Mellitus

SHI Zhengyuan，LI Jingfeng，BAO Li，YANG Chunjing，XU Xiqiao，YANG Lu

（Department of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

Abstract Objective：This study aims to explore the mechanism of Jinqi Jiangtang Tablets（JQJT） in the treatment of type 2 diabetes mellitus（T2DM） by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS/MS）.Methods：To be specific，T2DM was induced in rats with high-sugar and high-fat diet and streptozotocin（STZ） and the body weight，blood glucose，and other indicators were detected.UPLC-Q-TOF-MS/MS was employed to analyze the metabolic profiles of serum samples in control group，model group，positive drug group，JQJT normal group，and JQJT model group.Principal component analysis（PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA） were used to screen and identify the differential metabolites.Results：Metabolic profiling revealed 15 metabolites as the potential biomarkers distinguishing rats in model group from those in control group.The metabolomics pathway analysis（MetPA） was applied to investigate the underlying metabolic pathways.A major metabolic pathway was glycerophosphatide metabolism.Nine metabolites such as LysoPC（18∶0） and LysoPC（16∶1） were down-regulated in T2DM rats，and six metabolites such as LysoPC（18∶1） and LysoPC（20∶0） were up-regulated.Conclusion：Moreover，the fifteen biomarkers of each administration group had a trend of returning to the levels in rats in control group.The significantly-altered metabolite levels indicated that JQJT can improve the progression of T2DM by alleviating lipid metabolism disorder.

Keywords Jinqi Jiangtang Tablets; Type 2 diabetes mellitus; Metabolomics; UPLC-Q-TOF-MS; Serum; Chinese medicine; Glycerophosphatide metabolism; Biomarker

中圖分类号：R587.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.00878CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）又称非胰岛素依赖型糖尿病，是一种代谢性疾病，由于胰岛素缺乏导致机体代谢紊乱。目前糖尿病的治疗方法很多，包括合理控制饮食、适度运动、药物治疗等[1-5]。降糖药主要分为中药和西药。虽然中药的降糖速度和疗效不如西药，但中药在预防糖尿病并发症的发生和发展方面有一定的优势。因此，中药治疗糖尿病的机制越来越受到关注和重视[6]。

金芪降糖片（JQJT）源于孙思邈的《千金方》，是由黄连、黄芪、金银花组成的纯中药制剂。它是中国医学科学院药物研究所根据传统古方和现代药理学实验方法，通过对数百种中草药和植物药样品进行实验筛选、综合比较和评价而研制成的[7-8]。循证医学证明其治疗非胰岛素依赖型糖尿病的疗效确切，并于1993年获得卫生部科技进步三等奖。在西药降糖效果不理想、不良反应多的背景下，中医药在临床治疗T2DM中发挥了重要作用。经过20多年的临床检验，已成为国内治疗T2DM的经典中成药品种[9]。

代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化关系的学科[10-11]。与药理和生化指标比较，代谢组学可以提供更多关于机体内内源性物质的信息。因此，该方法在药物代谢、药物毒性筛选及作用机制等方面具有良好的应用前景[12-17]。代谢组学可以有效监测药物与代谢途径、生理病理变化的关系，结合临床生化指标评价药物对糖尿病的治疗效果[18-19]。本研究采用基于超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术的代谢组学研究方法，鉴定T2DM大鼠血清中相关生物标志物，分析其可能的代谢途径，探讨JQJT对T2DM代谢紊乱的影响，从代谢组学的角度阐明JQJT的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级雄性SD大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006]，6～7周龄，于IVC笼具饲养，4只每笼，实验室环境温度保持22 ℃，湿度保持50%左右。本研究已通过首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会的审批[伦理审批号：sjtkyll-lx-2021（4）]。

1.1.2 药物 金芪降糖片（天津中新药业集团股份有限公司，隆顺榕制药厂，批号：870016），二甲双胍（上海源叶生物科技有限公司，批号：K17D9Y77394），链脲佐菌素（Streptozocin，STZ，大连美仑生物技术有限公司，批号：S0923A）。

1.1.3 试剂与仪器 一水合柠檬酸和二水合柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170109，20161209）;10%水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20130201）;LC-MS级乙腈（Thermo Fisher Scientific，美国，批号：212213），HPLC级甲酸（上海安谱实验科技股份有限公司，批号：S1360050）;Acquity UPLC-Q-TOF液质联用仪（Waters公司，美国，型号：Xevo G2-XS）;Milli-Q Integral 5.5 Kit（CN）纯水仪（Millipore，美国，型号：Integral 5.5 Kit）;3K15低温离心机（Merck Sigma-Aldrich，Darmstadt，德国，型号：3K15）;Forma 88000系列-86 ℃超低温冰箱（Thermo scientific，美国，型号：88600）;代谢笼（Tecniplast，意大利，型号：2602）;罗氏卓越金采血糖仪、罗氏卓越金采血糖试纸[罗氏诊断产品（上海）有限公司，批号：477417]。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 80只大鼠适应性喂养1周后，随机选取24只喂养普通饲料，另外56只喂养高糖高脂饲料4周后，大鼠按40 mg/kg空腹腹腔注射STZ溶液（由柠檬酸缓冲液新鲜配制），喂养普通饲料的大鼠同时注射等体积的柠檬酸缓冲液。于注射STZ溶液3 d后，取大鼠尾尖血测定空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）浓度，血糖值≥11.1 mmol/L认为造模成功。喂养普通饲料的24只大鼠分为正常对照组与正常给药组，继续喂养普通饲料，每天固定时间分别灌胃给予生理盐水和中药。将造模成功的T2DM大鼠（36只）随机分为3组，每组12只，分别为模型组、阳性药组、中药组，均喂养高糖高脂饲料，每日固定时间按剂量灌胃给药1次，持續4周。

1.2.2 给药方法 JQJT研磨后用蒸馏水溶解，5.3 g粉末溶于10 mL蒸馏水中，按1 mL/100 g大鼠体质量给药，给药前摇匀。二甲双胍1 g粉末溶于50 mL蒸馏水中，按1 mL/100 g大鼠体质量给药。中药组、正常给药对照组：每日固定时间按剂量5.3 g/（kg·d）灌胃给予JQJT（按1 mL/100 mg体质量给药）。阳性药对照组：灌胃给予盐酸二甲双胍水溶液200 mg/kg（按1 mL/100 mg体质量给药）。正常对照组、模型组：灌胃给予蒸馏水，按1 mL/100 mg体质量给药。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 体质量记录 给高脂饲料前，高脂饲料饲养4周后，以及给药治疗4周后称体质量。

1.2.3.2 血糖记录 高脂饲料饲养4周后、注射STZ 3 d后以及给药治疗3 d后测FBG值。

1.2.3.3 血样收集 末次给药后，隔夜禁食，以5%水合氯醛麻醉后，于腹主动脉取血，血样在4 ℃条件下2 200×g，离心10 min，将分离得到的血清分装，-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3.4 血样前处理 将储存于-20 ℃冰箱中的待测尿样取出，置于室温条件下，至样品充分融化（1 h），将样品置于涡旋振荡器上震荡5 min;吸取血清样品50 μL置于1.5 mL塑料离心管中，然后取200 μL乙腈加入离心管中以沉淀蛋白，置于涡旋振荡器上震荡5 min，置于低温离心机4 ℃，21 000×g，条件下离心20 min，将上清50 μL置于1.5 mL EP管中，加入150 μL稀释液，涡旋混匀5 min，取混合后的样品200 μL，待UPLC-Q-TOF-MS/MS测定。78CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12

1.2.3.5 QC样品配制方法 分别吸取55个大鼠血清样品各50 μL，置于10 mL塑料离心管中，涡旋混匀后，吸取50 μL置于离心管中，然后取200 μL乙腈加入离心管中以沉淀蛋白，置于涡旋振荡器上震荡5 min，置于低温离心机4 ℃ 21 000×g，条件下离心20 min，将上清50 μL置于1.5 mL EP管中，加入150 μL稀释液，涡旋混匀5 min，取混合后的样品200 μL，待UPLC-Q-TOF-MS/MS测定。

1.2.3.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS条件及样本分析   色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm;Waters公司，美国，批号：0228393521）;进样量：2 μL，柱温：40 ℃，流动相：含0.1%甲酸的超纯水（A相）和含0.1%甲酸的质谱级乙腈（B相），梯度洗脱条件：0～1 min，1%B;1～12 min，1%～55%B;12～14 min，55%～99%B;14～16 min，99%B;16～18 min，99%～1%B，流速：0.4 mL/min。质谱条件：采用电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI），离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气流速50 L/h，脱溶剂气流速800 L/h，锥孔电压40 V，正离子模式下毛细管电压3 kV，负离子模式下毛细管电压-2 kV。

1.2.3.7 非靶向代谢组数据处理 将所有采集的数据通过Progenesis QI软件进行处理，包括原始数据导入、峰对齐、峰提取、归一化等步骤，最终形成包括保留时间、质荷比和峰强度的表。反相色谱峰提取时间为1～18 min，对加氢、加钠等各种添加剂离子进行去卷积处理。通过匹配人类代谢组学数据库和脂质数据库来鉴定代谢物。将所有样本均吸取固定体积，混合均匀后，得到质控样本，使用质控样本评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性。质控样品的前处理方法与其他样品相同。首先取空白样品5份进样，用于平衡色谱柱，然后取6份质控品平衡色谱条件。每进6～8个样品，插入1个质控品，以考察整个检测体系的重复性和稳定性。并计算质控品中提取的代谢物色谱峰的变异系数，对变异系数超过30%的代谢物色谱峰进行剔除。

1.3 统计学方法

样本的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）可以反映组内整体的变异性和样本间的代谢差异。对数据集进行归一化处理后，使用SIMCA-P 14.1软件对其进行正式分析，以得到更直观可靠的结果，归一化的目的是使所有变量的标度（一些数字特征，如均值和标准差）处于同一水平，从而避免由于复杂生物样品中不同代谢物浓度差异大导致的某些代谢物浓度过高，或过低代谢物的信号被掩盖，进而影响生物标志物的鉴定。PCA是一种无监督性的模型分析方法，它可以根据数据的相似性对其进行归类。因此，与偏最小二乘法判别分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）等监督模型分析方法比较，PCA能够更真实地反映组间差异，识别组内变异。为了获得导致这种显著差异的代谢物信息，我們进一步采用监督性的多维统计方法即OPLS-DA对2组样本进行统计分析。

本研究在寻找差异表达代谢物的过程中，使用了t-test的P值（P<0.05）和OPLS-DA模型的VIP值（Variable Importance in the Projection）（阈值>1）。差异代谢物的定性方法如下：1）在线检索数据库（HMDB）（比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限0.01 Da）;2）与本地的数据库相结合。

2 结果

2.1 JQJT对模型大鼠进食、饮水及体质量的影响  模型大鼠的进食量、饮水量和尿量比对照组均有显著增加（P<0.01）。与对照组比较，模型组体质量明显减轻，符合“三多一少”糖尿病的典型症状。与模型组比较，JQJT组和二甲双胍组的症状均能明显减轻（P<0.01）。

2.2 JQJT对模型大鼠血糖值的影响

模型组大鼠的血糖相比于对照组有明显升高（P<0.001），证明造模成功，连续给药4周后，各给药组的血糖相比于模型组均有所下降（P<0.001）。JQJT组和二甲双胍组大鼠的均有显著下降，证明JQJT对T2DM大鼠有一定的治疗作用（P<0.001）。

2.3 大鼠血清代谢组学分析

2.3.1 质控评估 首先使用无监督主成分分析（PCA）对QC样本和其他实验样本进行分析。QC样品成分相同，应在PCA得分图中聚集。ESI正离子模式、负离子模式分离的PCA得分见图1。样本PCA反向色谱正离子和反向色谱负离子的结果见图2。样本OPLS-DA分析，反向色谱正离子、反向色谱负离子的结果见图3。结果表明，该系统具有良好的重复性。

2.3.2 差异代谢物的筛选和鉴别 最后筛选出15个血清潜在生物标志物，对表LysoPE和LysoPC进行说明。见表1。

2.3.3 代谢通路分析 使用Met PA（https：//www.metaboanalyst.ca/）基于HMDB数据库和KEGG，对代谢途径进行分析，并通过代谢通路富集分析和拓扑分析的结果，找到最相关的代谢途径。从中筛选出相关的差异代谢物共15种，其中一条重要的代谢途径，确定为甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid Metabolism）。见图4。样品含量转换成可视化的热图。见图5。在JQJT组代谢物的含量回调，代谢途径的紊乱得到改善，在代谢层面证明了JQJT对T2DM有较好的治疗作用。

3 讨论78CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12

JQJT治療糖尿病疗效显著，目前，已有研究探讨了JQJT各成分的体外抗糖尿病作用及其机制[20-21]。然而，从内源性物质的角度来看，分析JQJT治疗糖尿病的作用机制尚缺乏相关研究。代谢组学的分析目标越来越有针对性，从所有小分子代谢产物中筛选出与疾病具有明显相关性的目标组分，不仅可以降低分析的难度、提高准确度，而且可以使生物标志物更容易用于临床和药物评价。本研究采用代谢组学的方法，研究了JQJT对T2DM大鼠代谢的影响。从JQJT给药前后内源性物质的变化趋势，探讨其治疗T2DM可能的代谢途径，为中医药治疗糖尿病的机制研究提供实验参考，对充分认识药物的性质，掌握其应用规律具有重要意义。

溶血磷脂通过激活特异的G蛋白偶联受体，产生一系列生理和病理反应，是生物第二信使。溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺都是甘油磷脂的代谢产物，糖尿病与慢性肾病等代谢性疾病的患者血清中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量均有异常改变。统计学分析表明，这两类脂质中间产物与糖尿病并发的炎症、氧化应激和动脉硬化等密切相关[22]。模型组与对照组比较溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺含量均明显上调或下调，揭示T2DM大鼠血清磷脂代谢紊乱，给予JQJT后，差异代谢物含量有不同程度回调。这些结果提示，JQJT治疗糖尿病的潜在机制是调节甘油磷脂代谢紊乱。

综上所述，代谢组学为中药从分子水平研究治疗疾病的机制提供了一种可行性的实验方法。本研究利用非靶向代谢组学分析，探讨JQJT对T2DM模型大鼠的治疗作用及其机制。通过PCA和OPLS-DA模式识别分析，完成了组间的区分和对差异代谢物的筛选。筛选得到的差异代谢物主要参与甘油磷脂代谢途径，提示JQJT主要通过调节脂质代谢紊乱来改善T2DM的病情。

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（2021-03-02收稿 本文编辑：吴珊）

基金项目：国家自然科学基金项目（82073741）——奇数碳溶血磷脂酰胆碱LPC（17：0）介导茯苓三萜C43改善2型糖尿病的机制学研究作者简介：时正媛（1984.07—），女，博士，副主任药师，研究方向：药物代谢组学，E-mail：zhengyuan9999@126.com

通信作者：杨璐（1983.03—），女，博士，主管药师，研究方向：临床药学，E-mail：yanglu0305@163.com78CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12