芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的网络药理学研究与实验验证

邹陶媛 宁云红 郭承伟

摘要 目的：通過网络药理学预测芍药甘草汤主要活性成分治疗葡萄膜炎的作用机制，并选择T细胞受体信号通路所介导T细胞转化后的效应分子γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-10进行验证。方法：检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中药分子机制生物信息学分析工具库（BATMAN-TCM），筛选芍药甘草汤成分、靶点和葡萄膜炎靶点。使用Cytoscape 3.7.2软件构建成分靶点网络、成分疾病靶点网络、靶点相互作用网络。拓扑分析筛选关键靶点后使用软件插件ClueGO进行基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析。采用光感受器间维生素A类结合蛋白混合完全弗氏佐剂及结核杆菌皮下注射复制实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，HE染色检测视网膜炎症变化，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清IFN-γ、IL-10含量。结果：芍药甘草汤中47种候选成分（白芍35种、炙甘草12种），涉及治疗葡萄膜炎作用靶点164个，拓扑分析关键靶点33个。富集分析结果表明，芍药甘草汤治疗葡萄膜炎可能与细胞对活性氧的反应、多种细胞增殖与分化、一氧化氮与神经递质等分子的代谢调节、IL-6的细胞反应等生物过程有关，涉及IL-17信号通路、TNF信号途径、Th17细胞分化、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-AKT信号通路等。芍药甘草汤可缓解大鼠视网膜炎症，降低炎症评分（P<0.01），减少IFN-γ和增加IL-10的含量（均P<0.01）。结论：芍药甘草汤治疗葡萄膜炎过程涉及多个重要炎症与免疫通路，这将成为研究其作用机制的重要参考。

关键词 芍药甘草汤;葡萄膜炎;网络药理学;炎症;免疫;实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型;γ干扰素;白细胞介素-10

Mechanism of Shaoyao Gancao Decoction against Uveitis：Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

ZOU Taoyuan1，NING Yunhong2，GUO Chengwei1，2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250355，China; 2 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250011，China）

Abstract Objective：This study predicted the targets of the active compounds of Shaoyao Gancao Decoction（SGD） through network pharmacology，to explore the mechanism of SGD against uveitis.Moreover，the effectors interferon（IFN）-γ and interleukin（IL）-10 after T cell receptor signaling pathway-mediated T cell transformation were selected for the verification.Methods：The components and targets of SGD and the targets of uveitis were searched from databases.The component-target network，component-disease target network，and protein-protein interaction network were constructed with Cytoscape 3.7.2.The key targets were screened by topological analysis，followed by Gene Ontology（GO） term and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment of the targets with Cytoscape 3.7.2 plug-in ClueGO.Autoimmune uveitis was induced in rats through subcutaneous injection of the mixture of inter-photoreceptor retinoid-binding protein and complete Freund′s adjuvant，and tubercle bacillus.The changes of retinal inflammation were detected based on hematoxylin and eosin（HE） staining and the content of IFN-γ and IL-10 in serum was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：A total of 47 candidate components（35 from Radix Paeoniae Alba and 12 from Radix Glycyrrhizae Preparata） of SGD，164 targets against uveitis，and 33 key targets were screened out.The key targets were mainly involved in the biological processes such as cell response to reactive oxygen species，proliferation and differentiation of various cells，metabolic regulation of nitric oxide and neurotransmitters，and cellular response of IL-6，and the pathways of IL-17 signaling pathway，tumor necrosis factor（TNF） signaling pathway，Th17 cell differentiation，T cell receptor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway，etc.SGD can relieve retina inflammation，decrease inflammation score（P<0.01），lower IFN-γ level，and raise IL-10 content（Ps<0.01），which validated part of the prediction results of network pharmacology.Conclusion：SGD exerts therapeutic effect on uveitis through multiple important immune and inflammatory pathways，which can serve as a reference for exploring the mechanism.641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

Keywords Network pharmacology; Shaoyao Gancao Decoction; Uveitis; Inflammation; Immune; Experimental autoimmune uveitis; IFN-γ; IL-10

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.005

葡萄膜炎是眼科常见疾病，也是主要致盲眼病之一。研究表明，各种类型葡萄膜炎的总体致盲率高达18.76%，其中白塞综合征的致盲率甚至超过30.00%，与青光眼致盲率相近[1]。葡萄膜炎以青壮年患者为主，导致患者过早丧失劳动能力[2]。研究表明，自身免疫反应是除感染因素外导致葡萄膜炎发生的最重要原因[3]。中医中药在葡萄膜炎的治疗和后期康复的过程中被广泛应用，可以通过调节人体免疫功能以达到抗炎的作用，并取得良好成效[1]。

葡萄膜炎中医称为“瞳神紧小”病，是瞳神持续性缩小，展缩失灵的病理状态。芍药甘草汤最早见于《伤寒论》，为柔肝缓急的代表方剂，主治筋脉痉挛疼痛。本课题组前期研究发现，该病的潜在病因与肝失濡养，阴虚而致虚火上炎有关[4]，故以芍药甘草汤治疗葡萄膜炎，病证相合。同时，课题组也开展相应临床试验，结果显示芍药甘草汤治疗葡萄膜炎效果显著，可提高患者视力，降低中医证候积分[5]。

鉴于芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的机制尚未充分阐明，故选择网络药理学的研究方法，筛选芍药甘草汤的主要活性化学成分及作用靶点，收集葡萄膜炎已知的疾病靶点，根据网络拓扑分析及Cytoscape 3.7.2软件ClueGO插件富集分析结果，挖掘芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的多成分、多靶点作用机制，并通过复制实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis，EAU）大鼠模型，使用芍药甘草汤治疗后验证相关结果，为芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的炎症机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

5～8周龄SD大鼠，雄性，30只，体质量为（180±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[动物许可证号：SCXK（鲁）20130009]。行常规检查，排除眼部疾患后于山东中医药大学附属医院动物实验中心屏障环境设施适应性饲养1周，光照交替12 h环境，自由获得饮水及饲料。

1.1.2 药物

白芍、炙甘草由山东中医药大学附属医院提供。

1.1.3 试剂与仪器

完全弗氏佐剂（Complete Freund′s Adjuvant，CFA）（sigma公司，美國，货号：F5881）;光感受器间维生素A类结合蛋白（Interphotoreceptor Retinoid-binding Protein，IRBP）（上海生工生物有限公司，批号：P21622）;结核分枝杆菌H37RA（BD Difco公司，美国，货号：M4537）;γ干扰素（Interferon，IFN-γ）、白细胞介素（Interleukin，IL）-10 ELISA Kit（eBioscience公司，美国，货号：BMS621、BMS629）;苏木精-伊红（HE，天津市北连精细化学有限公司，批号：20160801）。

光学显微镜（Olympus公司，日本，型号：BX51-DP20）;冷冻离心机（Eppendorf公司，德国，型号：5424R）;Multiskan GO酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司，美国，型号：1510）。

1.2 方法

1.2.1 芍药甘草汤所含主要化学成分的收集与筛选

本研究使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）[6]，中药分子机制生物信息学分析工具库（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsd.org/batman-tcm）[7]，以“白芍”“炙甘草”为关键词检索2味中药的主要化学成分。其中，TCMSP数据库选择化合物的筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18，BATMAN-TCM数据库设置相似性模型阈值Score cutoff≥20，P≤0.05[8]。另外，结合芍药甘草汤相关化学成分的文献数据，以主要化学成分具有生物活性和药理作用为标准，补充上述数据库的不足。最后，使用有机小分子生物活性数据库（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[9]对主要化学成分进行查询，获取化合物SMILES等信息，建立“中药-化学成分”数据集。

1.2.2 化学成分潜在靶点的收集与筛选

使用TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库收集芍药甘草汤候选化学成分的同时，记录数据库收录的潜在靶点。另外使用Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）[10]检索，以配体预测方法预测相关化合物的潜在靶点。对所收集靶点使用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）[11]剔除非人源靶点，并校正所有蛋白名称为官方名称，建立“中药-化学成分-靶点”数据集，使用Cytoscape 3.7.2构建“中药-化学成分-靶点”网络图。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

1.2.3 葡萄膜炎的疾病靶点收集与筛选

本研究使用治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd）[12]、DRUGBANK数据库（https：//www.drugbank.ca）[13]、DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/home/）[14]、比较毒物遗传学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org）[15]、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）[16]、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.omim.org）[17]、GAD数据库（https：//geneticassociationdb.nih.gov）[18]，以“uveitis”为关键词检索，收集相关的靶点基因，并通过Uniprot数据库校正，去除重复项，建立“疾病-靶点”数据集。

1.2.4 “中药-化学成分-靶点”和“疾病-靶点”交集网络构建与关键靶点筛选

将所得“中药-化学成分-靶点”数据集与“疾病-靶点”数据集进行韦恩分析，建立“中药-化学成分-靶点-疾病”数据集，构建数据网络，初步挖掘芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的作用靶点。

将“中药-化学成分-靶点-疾病”数据集中靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）[19]，限定物种为“Homo sapiens”，构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络。通过Cytoscape 3.7.2软件插件CytoNCA[20]对所得PPI网络进行拓扑分析，分析内容包括中心性（Degree Centrality，DC）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC），并计算相应的中位数值。关键靶点为DC值大于2倍DC中位数值，且BC、EC、CC指标大于所有节点中位数的节点。

1.2.5 富集分析

采用Cytoscape 3.7.2软件插件ClueGO[21]进行芍药甘草汤活性成分治疗葡萄膜炎关键靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能注释富集分析。富集分析内容包括生物过程和信号通路，分析芍药甘草汤治疗葡萄膜炎可能的作用机制。计算富集结果的每个P值，以P<0.05为筛选条件，P<0.01被认为是显著富集，获得显著富集的生物学过程和信号通路。

1.2.6 溶液制备

称取白芍400 g、炙甘草400 g，浸泡30 min，煎煮2次，一煎加5.5倍量的水，二煎加4倍量水，过滤，合并水煎液，减压浓缩得到芍药甘草汤水提液800 mL，浓度为1 g/mL（按生药量计算），备用。大鼠临床等效剂量为1.2 g/100 g，则芍药甘草汤水提液按1.2 mL/100 g灌胃给药，1次/d，连续14 d。

1.2.7 实验分组与造模

30只SD大鼠随机分为对照组、模型组、芍药甘草汤组，每组10只。实验采用大鼠皮下注射IRBP的方法建立EAU动物模型。于超净台内配制含IRBP的磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered Saline，PBS）0.6 mL，与结核分枝杆菌H37RA粉剂10 mg，PBS 1.4 mL，CFA 2 mL，充分混合，得乳剂4 mL。分別自大鼠足垫中部皮下进针，向上潜行至腔骨上端皮下处，每侧缓慢推注混合乳剂0.1 mL。

1.2.8 HE检测大鼠视网膜病理变化

灌胃2周后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，处死动物摘取眼球后，置于4%多聚甲醛溶液中固定过夜。石蜡包埋，经瞳孔视乳头轴作矢状切面切片（4 μm）。对组织切片进行HE染色，光学显微镜下观察形态学改变及炎症细胞浸润情况，依据Caspi眼部组织病理评分标准进行病理学评级[22]。

1.2.9 ELISA检测大鼠血清IFN-γ及IL-10的含量

大鼠灌胃2周后收集心脏血，4 ℃离心（3 000×g，15 min）后取上清，采用ELISA测定血清中IFN-γ、IL-10含量。依据说明书进行操作，酶标仪在450 nm下测定吸光度，计算各组大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量。

1.3 统计学方法

实验数据统一用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析，各组间的两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芍药甘草汤的“中药-化学成分”数据集

对白芍与炙甘草进行化学成分检索后筛选，删除重复项，记录SMILES信息[Paeoniflorin_qt（芍药苷元）在PubChem中未检索到]，共得到化合物44个，包括白芍35个和炙甘草9个。而文献检索结果显示，甘草中甘草苷、甘草素与甘草查尔酮A在炮制后含量明显升高，且具有明显的抗炎、抗肿瘤等活性[23]。见表1。

2.2 芍药甘草汤的“中药-化学成分-靶点”网络

通过TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库与Swiss Target Prediction数据库获得芍药甘草汤候选化学成分的潜在靶点，通过Uniprot数据库校正，获得白芍候选成分治疗靶点600个，炙甘草323个，删除重复项后获得芍药甘草汤候选成分潜在靶点712个。“中药-化学成分-靶点”网络由761个节点和1 975个边组成。见图1。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

2.3 葡萄膜炎的“疾病-靶点”数据集

使用TTD数据库、DRUGBANK数据库、DisGeNET数据库、CTD数据库、GeneCards数据库、OMIM数据库、GAD数据库，分别收集葡萄膜炎相关靶点基因2、160、10、25、994、12、18个，校正删除重复项后获得靶点995个。

2.4 “中药-化学成分-靶点-疾病”数据集与关键靶点筛选

将“中药-化学成分-靶点”数据集与“疾病-靶点”数据集中靶点进行韦恩分析，建立“中药-化学成分-靶点-疾病”数据集，构建数据网络。见图2。获得芍药甘草汤27个候选治疗葡萄膜炎的潜在靶点基因164个，该网络由193个节点和468个边组成。见图2。

将芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的潜在靶点基因导入STRING数据库，限定物种为“Homo sapiens”，获得PPI网络由163个点，2 164个边组成。使用CytoNCA对PPI网络进行拓扑分析，计算网络节点DC中位数为20、BC中位数为51.619 110、EC中位数为0.045 793、CC中位数为0.490 909。根据网络药理学筛选方法，选择DC>40并綜合BC>51.619 110、EC>0.045 793、CC>0.490 909的节点，得到33个关键靶点，同时获得芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的关键靶点PPI图。见表2，图3。

2.5 富集分析

GO富集分析结果涉及95个生物过程（P<0.05），主要包括细胞对活性氧的反应、多种细胞的增殖与分化、一氧化氮与神经递质等分子的代谢调节、IL-6的细胞反应等（P<0.01）。见图4（前20位）。KEGG信号通路富集分析的结果涉及117个信号通路（P<0.05），主要包括TNF信号途径、IL-17信号通路、Th17细胞的分化、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-AKT信号通路等（P<0.01），同时，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、前列腺癌、弓形虫病等也被显著富集。见图5（前20位）。

2.6 芍药甘草汤对EAU大鼠视网膜病理的影响

HE染色结果显示，与对照组比较，模型组视网膜各层结构排列明显紊乱、迂曲，内、外核层细胞大小较一致，部分细胞空泡变性;丛内神经节细胞层、内网状层及内核状层、外核层出现炎症细胞浸润。经芍药甘草汤治疗后，视网膜各层结构表现为轻度迂曲;神经节细胞层、内网状层及内核状层出现少量炎症细胞浸润。见图6。相应炎症评分显示，模型组大鼠炎症评分高于对照组，而芍药甘草汤治疗后炎症评分显著下降（P<0.01）。见表3。

2.7 芍药甘草汤对EAU大鼠血清IFN-γ、IL-10的影响

ELISA检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量升高（P<0.01），与已报道EAU动物模型的表达趋势一致[24]。经芍药甘草汤治疗后，大鼠血清中炎症介质IFN-γ含量显著下降（P<0.01），抗炎因子IL-10含量进一步升高（P<0.01）。见图7。

3 讨论

目前，我国治疗葡萄膜炎的药物主要是散瞳剂和睫状肌麻痹剂、糖皮质激素、非甾体抗炎药和免疫抑制剂等[25]。但临床应用时存在有药物不良反应、患者依从性较差等局限性，不同程度上影响疾病的治疗。

本研究利用网络药理学讨论芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的理论机制。结果显示，芍药甘草汤中47种候选成分，包括芍药35种和炙甘草12种，涉及治疗葡萄膜炎的作用靶点164个，经拓扑分析后获得关键靶点33个。富集分析研究结果表明，芍药甘草汤治疗葡萄膜炎可能与细胞对活性氧的反应、多种细胞的增殖与分化、一氧化氮与神经递质等分子的代谢调节、IL-6的细胞反应等生物过程有关，涉及到IL-17信号通路、TNF信号途径、Th17细胞的分化、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-AKT信号通路等。KEGG结果表明，芍药甘草汤治疗葡萄膜炎可能与IL-17信号通路、Th17细胞的分化有关。研究显示，葡萄膜炎患者活动期Th17细胞比例及相关细胞因子水平升高，而Treg细胞出现相应水平下降[26]。本课题组前期已通过实验研究发现，在实验性免疫性葡萄膜炎大鼠模型中，芍药甘草汤能够下调IL-17表达而减大鼠眼部炎性病变[4]，这证实了本研究预测结果的准确性。

本研究还预测芍药甘草汤治疗葡萄膜炎可通过影响T细胞信号受体通路实现。研究表明，初始CD4+T细胞在T细胞受体介导下活化，可分化为Th1、Th2、Th17和Treg细胞而参与不同类型的免疫应答。葡萄膜炎被认为是由CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病，主要侵犯视网膜和葡萄膜[27]。在EAU模型中，引起趋化单核细胞聚集至眼的IFN-γ增加[28]，IFN-γ是一种炎症介质;而抗炎因子IL-10可通过抑制T细胞、单核细胞或巨噬细胞的活化等对抗EAU[29-30]。本研究通过复制EAU大鼠模型，使用芍药甘草汤治疗后发现，EAU大鼠视网膜炎症反应明显下降，可能与IFN-γ的减少和IL-10的增加有关，实验结果进一步证明网络药理学的准确性。此外，Mizuki等[31]通过体内实验发现，EAU的发病期外周血液中TNF-α水平急剧上升，在缓解期外周血液中TNF-α水平有所下降。给实验动物皮下注射TNF-α后，可使EAU的发病率与相关病情显著增加[32]。而本研究结果预测，芍药甘草汤可能通过干预TNF信号途径治疗葡萄膜炎，这可成为未来进一步的实验研究方向的基础。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法预测了芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的主要机制，涉及多种有效成分、靶点和通路，并在课题组已有的临床与实验结果基础上，进一步检测芍药甘草汤对EAU的IFN-γ、IL-10的影响。为研究芍药甘草汤活性成分的作用靶点和作用机制提供思路和依据，也为该方的临床应用与药物开发提供参考。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

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（2021-03-24收稿 本文编辑：张乐杰）

基金项目：山东省中医药科技发展计划项目（2019-0086）作者简介：邹陶媛（1995.11—），女，硕士研究生在读，研究方向：眼底病与炎症性眼病的研究，E-mail：940032160@qq.com通信作者：郭承伟（1964.11—），男，博士，教授，主任医师，研究方向：眼底病的理论与临床研究，E-mail：guocw12009@163.com641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0