基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体探讨天麻钩藤颗粒对肝阳上亢证肾损害的作用机制

孙治琪 刘晨笑 孟玥 赵永烈 刘子旺

摘要 目的：通過对大鼠血压、血清炎症介质及肾脏病理学切片的检测，探讨天麻钩藤颗粒对高血压大鼠肝阳上亢证肾损害的改善作用及机制。方法：取32只自发性高血压大鼠（SHRs），随机分为对照组、模型组、天麻钩藤颗粒组（中药组）、尼莫地平组（西药组），每组8只，其中模型组、中药组、西药组给予附子汤灌服进行肝阳上亢证造模，再分别给予蒸馏水、天麻钩藤颗粒、尼莫地平灌服14 d。6只正常SD大鼠作为空白组，空白组、对照组给予蒸馏水灌服42 d。干预前后分别测量血压，干预后进行血清炎症介质核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶（Caspase）-1及肾脏病理学切片检测。结果：西药组干预后收缩压明显降低（P<0.05），余干预前后变化不明显（P>0.05）;与正常组比较，对照组、模型组、中药组大鼠血清中NLRP3、ASC、Caspase-1水平均升高，中药组较对照组、模型组较低（P<0.05）;与空白组比较，对照组、模型组、中药组、西药组均出现肾小球缺血性表现，肾小球固缩，部分肾小球纤维化和玻璃样变，肾小管萎缩、消失，其中中药组、西药组较对照组、模型组2组病变有所减轻。结论：天麻钩藤颗粒对自发性高血压大鼠肝阳上亢证肾损害具有改善作用，其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体合成有关。

关键词 自发性高血压大鼠;肝阳上亢证;肾损害;核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体;天麻钩藤颗粒;平肝潜阳;作用机制

Mechanism of Tianma Gouteng Granules against Kidney Damage in SHRs with Ascendant Hyperactivity of Liver Yang：Based on NLRP3 Inflammasome

SUN Zhiqi，LIU Chenxiao，MENG Yue，ZHAO Yonglie，LIU Ziwang

（Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：This study aims to investigate the mechanism of Tianma Gouteng Granules against renal damage in hypertension rats with the pattern of ascendant hyperactivity of liver yang based on blood pressure，serum inflammatory factors，and kidney pathological sections.Methods：A total of 32 spontaneously hypertensive rats（SHRs） were randomized into control group，model group，Tianma Gouteng Granules group（Chinese medicine group），and nimodipine group（western medicine group），8 in each group.Fuzi Decoction was used（i.g.） to induce the pattern of ascendant hyperactivity of liver yang in the model group，Chinese medicine group，and western medicine group，respectively，and then they were separately treated with distilled water，Tianma Gouteng Granules，and nimodipine for 14 days.Six normal SD rats were treated as blank group，and the blank group and control group were given（i.g.） distilled water for 42 days.Blood pressure was measured before and after intervention.Serum inflammatory factors nucleotide-binding domain-like receptor protein3（NLRP3），apoptosis-associated speck-like protein containing CARD（ASC），and caspase-1 were detected and renal pathological sections were observed after intervention.Results：The systolic blood pressure was reduced in the western medicine group after intervention（P<0.05），and the variation in blood pressure after intervention was not significant in other groups（P>0.05）.The serum levels of NLRP3，ASC，and caspase-1 in the control group，model group，and Chinese medicine group were higher than those in the blank group，and the levels in the Chinese medicine group were lower than those in the control group and the model group（P<0.05）.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

pared with the blank group，the control group，model group，Chinese medicine group，and western medicine group all showed glomerular ischemic manifestations，glomerular shrinkage，partial glomerular fibrosis and hyaline degeneration，and tubular atrophy and disappearance，and these pathological changes were milder in the Chinese medicine and western medicine groups than in the control and model groups.Conclusion：Tianma Gouteng Granules can relieve the kidney damage in SHRs with ascendant hyperactivity of liver yang possibly by inhibiting the synthesis of NLRP3 inflammasome.

Keywords Spontaneously hypertensive rats; Syndrome of ascendant hyperactivity of liver yang; Renal damage; NLRP3 inflammasome; Tianma Gouteng Granules; Pacifying liver and subduing yang; Mechanism

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.007

高血压是心血管疾病中发病率最高的疾病之一，持续性的高血压可损伤重要脏器，如心、脑、肾的结构和功能，最终导致器官衰竭[1]。研究发现，高血压是引起肾脏损害和终末期肾病的重要危险因素[2]。高血压肾损害在中医古籍中无明确记载，属“眩晕”“癃闭”“水肿”等范畴[3]。其中，肝阳上亢型高血压更容易引起肾脏疾病发生[4]。本实验中用附子汤灌胃自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHRs）进行肝阳上亢证造模，天麻钩藤颗粒进行治疗干预，通过对血压、相关血清学指标及肾脏病理学切片的检测，旨在探讨天麻钩藤颗粒对自发性高血压肝阳上亢证肾脏损害的改善作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

自发性高血压大鼠32只，雄性，8周龄，体质量（200±10）g。正常清洁级，SD（Sprague Dawley）大鼠6只，雄性，8周龄，体质量（200±10）g。以上大鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。实验室定期消毒、清洁，保持通风，温度20～25 ℃、湿度（55±2）%。实验前，大鼠适应性饲养1周，自由进食饮水。实验中遵循3R原则，实验通过北京中医药大学伦理委员会审议（伦理审批号：BUCM-4-2019-092402-3070），符合动物伦理委员会的要求。

1.1.2 药物

附子汤（由北京中医药大学第三附属医院中药房提供）、天麻钩藤颗粒（成都九芝堂金鼎药业有限公司，国药准字Z51021084）、尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司，国药准字H14022821）。

1.1.3 试剂与仪器

苏木精染液（Beyotime，货号：C0107）;伊红（北京索莱宝生物技术有限公司，货号：G1100）;核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3，NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated Speck-like Protein，ASC）、胱天蛋白酶（Caspase-1）Elisa试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，货号：JM-05426H1）;DAB显色试剂盒（中山金桥，货号：ZLI-9018）;免疫组织化学抗原修复套盒（北京诺博莱德科技有限公司，货号：MYZHXFTH）;大鼠无创尾动脉测压仪（北京软隆科技有限责任公司，型号：Softron BP-2010A）;酶标仪（BioTek公司，美国，型号：ELX800）;倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：BX51）;脱色摇床（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：TS-1）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

分组：32只SHRs随机分为自发性高血压组（对照组）、自发性高血压肝阳上亢证（模型组）、天麻钩藤颗粒观察组（中药组）、尼莫地平片组（西藥组）各8只。

模型制备：附子汤制备方法：90 g单味制附子浸泡30 min，煎煮2次，将2次药液合并浓缩为含生药量为0.2 g/mL的药液，4 ℃保存备用。参照鄢东红等[5]的方法，给SHRs灌服附子汤，10 mL/（kg·d），相当于生药用量为2 g/（kg·d），共灌服28 d。灌服后，大鼠出现烦躁、眼结合膜充血、饮水量增加等症状，证明肝阳上亢证造模成功。

1.2.2 给药方法

正常成年人天麻钩藤颗粒服用剂量是30 g/d，尼莫地平片的剂量是60 mg/d，根据人与大鼠的换算系数6.25计算，大鼠天麻钩藤颗粒和尼莫地平的灌胃剂量分别是3.125 g/（kg·d）、6.25 g/（kg·d），用蒸馏水把天麻钩藤颗粒、尼莫地平片分别配制成0.312 5 g/mL、0.625 g/mL的药液，4 ℃保存备用。其中模型组、中药组、西药组大鼠适应性喂养5 d后10 mL/（kg·d）灌服附子汤制造肝阳上亢证模型。28 d后，再分别给予蒸馏水、天麻钩藤颗粒混悬液、尼莫地平水溶液灌服14 d进行治疗干预。另取6只正常SD大鼠作为空白组，对照组、空白组均给予蒸馏水灌服42 d。7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 毛发、眼结合膜改变情况及24 h饮水量变化

依次观察所有大鼠毛发、眼结合膜充血情况及24 h饮水量变化，造模前后分别检测1次。

1.2.3.2 血压测量

各组大鼠分别于干预前、后进行血压测量，每只大鼠在静息状态下测量3次，取平均值。

1.2.3.3 血清指标检测

干预结束后，5%戊巴比妥钠腹腔麻醉，取腹主动脉血5 mL于抗凝采血管中，4 000 r/min转速离心3 min，离心半径16 cm，重复3次，分离血清后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测血清中NLRP3、Caspase-1、ASC的水平，每只大鼠检测2次取平均值。

1.2.3.4 肾脏病理学切片

腹主动脉取血后，每组随机选取4只大鼠，剥离肾脏组织，4%的多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，进行连续切片，厚5 μm，每片相距30 μm，常规脱蜡后行苏木精-伊红（HE）染色，于200倍镜下拍照。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以百分率表示，采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠毛色、眼结合膜及24 h饮水量的变化

造模前各组大鼠饮水量、毛色、眼结合膜观察差异无统计学意义（P>0.05）。模型组、中药组、西药组给予附子汤灌服28 d后，出现毛发蓬松无光泽，眼结合膜呈明显充血状，颜色加深。模型组、中药组、西药组较空白组、对照组饮水量显著增加（P<0.05），呈现与人相似的口渴、烦躁、目赤等肝阳上亢证表现，提示造模成功。见表1。

2.2 各组大鼠体质量、血压测量结果

干预前，与空白组大鼠比较，对照组、模型组、中药组、西药组血压均较高（P<0.05），提示SHRs较SD大鼠血压高，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。对照组、模型组、中药组及西药组组间差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。干预前后中药组血压变化不明显（P>0.05）。干预后，西药组收缩压明显降低（P<0.01），西药组舒张压与中药组收缩压、舒张压变化不明显（P>0.05），其他组血压值较空白组高（P<0.01）。各组体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠血清炎症介质检测结果

NLRP3、Caspase-1、ASC3血清炎症介质检测结果显示，中药组、西药组较空白组水平升高（P<0.05），较对照组、模型组水平降低（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠肾脏病理学HE染色结果

肾脏HE实验结果显示，与空白组比较，对照组、模型组、中药组、西药组均出现肾小球缺血性表现，并见肾小球固缩，部分肾小球纤维化和玻璃样变，肾小管萎缩、甚至消失，其中中药组、西药组较对照组、模型组2组病变有所减轻。见图1。

3 讨论

高血压是常见的心血管系统疾病，由高血压导致的肾损害的发病率也在逐年上升。该病在西方国家常见，据统计显示，高血压是终末期肾衰的第2位病因[6]。对于高血压导致肾损害的发病机制，有学者提出了炎症反应在高血压肾损害发病中的重要作用，其中NLRP3炎症小体与高血压及肾脏疾病的发生密切相关[7-8]。

NLRP3炎症小体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶前体（Pro-Caspase-1）组成的一种多蛋白多聚体，在受到氧化应激、微生物感染等刺激因子作用时被激活成巨大的炎症小体复合物，作为该炎症反应的上游因子，能够诱导产生C反应蛋白（C-reactive Protein，CRP）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）等多种下游炎症介质[9]。研究发现，高血压肾病的发病与体内IL-1β、TNF-α、CRP等炎症介质水平密切相关[10-11]。实验中，肾脏HE染色结果显示对照组、模型组、中药组、西药组均出现不同程度的肾小球缺血、固缩，部分肾小球纤维化和玻璃样变，肾小管萎缩、消失等表现;结合酶联免疫吸附试验法检测结果，即对照组、模型组、中药组、西药组血清炎症介质NLRP3、Caspase-1、ASC水平较空白组明显升高。证明了高血压状态下，炎症反应在肾损害发病中的重要作用。姜玉红等[12]在实验中亦发现肾衰竭患者血清炎症介质升高，与本实验研究结果相似。

治疗上，对于高血压导致的肾损害，西医尚无有效的治疗措施，多以控制原发病、降低蛋白尿、护肾为主，虽能有效降低血压、改善肾功能，但对控制炎症反应、改善肾脏微循环效果欠佳，故無法控制肾损害的发展进程。中医方面，根据其头晕、目眩、腰膝酸软、小便不利或夜尿频多等症状，可归为“眩晕”“水肿”“癃闭”等范畴[13]。在高血压证型中，肝阳上亢证更容易引起肾损害[14]。多因肝阴亏虚日久累及肾阴，肾阴亏虚，抑制功能减退，肾封藏作用失职，关门不利，致夜尿频多，或久病阴损及阳，肾阳不足，蒸腾气化无力，气不化水，故小便不利等。肾脏组织缺血、固缩、萎缩等病理结果亦是中医理论中肝阳亢于上、阴血亏于下的道理。基于肝阳上亢的基本病机，多采用平肝潜阳、补益肝肾的方法治疗。天麻钩藤饮是治疗肝阳上亢证的经典方剂，原方出自胡光慈的《中医内科杂病证治新义》，由天麻、钩藤、石决明、黄芩、栀子、益母草、牛膝、桑寄生、杜仲、茯神、夜交藤11味药物组成。全方合用，共奏平肝潜阳，滋补肝肾之功，与实验模型方证对应。现代药理学研究发现，天麻钩藤饮可以降低血管紧张素，并能有效干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统[15]。此外，天麻钩藤饮还能改善血管内皮功能，抑制钙离子内流，调节离子通道，从而发挥降压作用[16-18]。中医通过辨证论治，整体考虑治疗方案，灵活选方用药，可有效延缓高血压导致的肾功能损伤发展进程[19-20]。7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

在本实验中，用加灌附子汤28 d的方法复制了高血压肝阳上亢证模型。进行造模的3组（模型组、中药组和西药组），出现毛发蓬松无光泽，眼结合膜呈明显充血状，饮水量明显增加，与人类肝阳上亢证症状相似，提示造模成功。干预后，血清学指标方面显示，与模型组、对照组比较，中药组、西药组血清中的上游炎症介质NLRP3、ASC、Caspase-1水平显著降低。病理方面，中药组、西药组肾小球缺血、固缩、纤维化及肾小管萎缩程度较对照组、模型组明显减轻。由此认为天麻钩藤饮能够显著降低血清中NLRP3、ASC、Caspase-1水平，从该通路上游抑制炎症反应的发生，从而减轻肾脏组织损伤程度。

综上所述，实验结果显示天麻钩藤颗粒对高血压大鼠肝阳上亢证导致的肾脏损害具有改善作用，其作用机制可能与抑制炎症小体的活化，进而控制肾脏局部炎症反应有关，这为高血压肾病后期的中医治疗提供了理论依据及思路指导。本实验不足之处为干预前后中药组血压变化不明显，考虑干预时间较短造成结果偏倚性较大，这些欠缺将在后期的实验中进一步完善。

参考文献

[1]中国高血压防治指南（2018年修订版）[J].中国心血管杂志，2019，24（1）：24-56.

[2]郑亚威，吴力菲，赵宇浩，等.活血化瘀类中药注射剂治疗高血压肾病的网状Meta分析[J].中国中药杂志，2020，45（20）：4997-5007.

[3]孙伟茗，焦晓民.高血压中医病名、病因、病机研究进展[J].实用中医内科杂志，2021，35（1）：101-105.

[4]段光堂，王慧敏，裴朝华，等.补肾化瘀泄浊法为主治疗高血压性肾损害的临床观察[J].中国中医药科技，2010，17（5）：440-441.

[5]鄢东红，金益强，肖纯，等.自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型的复制[J].湖南中医学院学报，1999，19（4）：35-38.

[6]王力宁，姚丽.高血压性肾损害[J].中华肾脏病杂志，2005，21（10）：569-571.

[7]阿希，李玉琳，王绿娅，等.炎症小体Nlrp3在高血压小鼠心肌纤维化中的作用[J].心肺血管病杂志，2015，34（6）：496-500.

[8]玄红运，陈云燕，王彩丽.炎症小体与肾脏疾病[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2018，27（4）：369-373.

[9]韩玉泽，田峥，钟雷.基于NLRP3信号通路探讨活血通脉颗粒对急性心肌梗死大鼠免疫炎症紊乱的干预作用[J].中国医药生物技术，2019，14（5）：436-444.

[10]Elmarakby AA，Quigley JE，Pollock DM，et al.Tumor necrosis factor alpha blockade increases renal Cyp2c23 expression and slows the progression of renal damage in salt-sensitive hypertension[J].Hypertension，2006，47（3）：557-62.

[11]Borges DL，Lemes HP，de Castro Ferreira V，et al.High-sensitivity C-reactive protein，apolipoproteins，and residual diuresis in chronic kidney disease patients undergoing hemodialysis[J].Clin Exp Nephrol，2016，20（6）：943-950.

[12]姜玉紅，王正椋，李香云，等.针刺联合益肾活血解毒法对老年急性肾衰竭患者肾功能、炎症因子和血流动力学的影响[J].中国老年学杂志，2019，39（17）：4250-4253.

[13]莫嘉浩，綦向军，许洪彬，等.中药注射液治疗慢性肾功能不全的贝叶斯网状Meta分析[J].中国中药杂志，2021，46（2）：454-466.

[14]谭雨晴，陈恒文，李军，等.中医药防治正常高值血压的临床研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（15）：224-228.

[15]Liu W，Wang L，Yu J，et al.Gastrodin Reduces Blood Pressure by Intervening with RAAS and PPARγ in SHRs[J].Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015：828427.

[16]Dai R，Wang T，Si X，et al.Vasodilatory effects and underlying mechanisms of the ethyl acetate extracts from Gastrodia elata[J].Can J Physiol Pharmacol，2017，95（5）：564-571.

[17]李钦青，柴金苗，郭蕾.HPLC法同时测定复方天麻钩藤口腔崩解片中3种成分[J].中成药，2016，38（2）：315-318.

[18]Loh YC，Ch′ng YS，Tan CS，et al.Mechanisms of Action of Uncaria rhynchophylla Ethanolic Extract for Its Vasodilatory Effects[J].J Med Food，2017，20（9）：895-911.

[19]栗源，可燕，蒋嘉烨，等.天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管功能及肾脏蛋白表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2015，35（4）：481-487.

[20]龙霖梓，褚剑锋，沈阿灵，等.中医药通过抗氧化途径防治高血压肾损害的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2021，19（5）：765-769.

（2020-08-30收稿 本文编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81373591）——芎芷地龙汤对偏头痛模型三叉神经血管系统PKC通路调节作用的研究;北京中医药大学第三附属医院在读研究生项目（2019-XS-ZB13）作者简介：孙治琪（1995.01—），男，硕士研究生在读，研究方向：中医药防治心脑血管疾病的研究，E-mail：460332057@qq.com

通信作者：刘子旺（1972.08—），男，博士，主任医师，研究方向：中医药防治心脑血管疾病的研究，E-mail：liuziw@163.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F