魔芋种间分子鉴定的SSR标记开发

高 永

(曲靖师范学院 生物资源与食品工程学院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

魔芋属(Amorphophallus)属于天南星科多年生草本植物，该属物种的地下球茎富含可溶性膳食纤维—葡甘露聚糖，对人体降血脂、降血糖、减肥等具有一定功效，在很多东亚国家被作为绿色健康食品[1].在我国，魔芋作为药用植物及食物的来源有近2000年的栽培和利用历史[2].我国魔芋的主栽种为花魔芋(A.konjac)，该种因产量高、葡甘聚糖含量较高、生长适应性广，具有很高的经济价值.而其它魔芋种由于适应性及品质等原因，在我国栽培范围相对较窄[3].魔芋属各物种之间的形态差异较小且不稳定，一般只能依据花形态才能对各种进行可靠判定，但魔芋通常四到五年才开花，这对利用花形态对其进行物种鉴定造成了一定困难(图1).近年来，农民种植过程中选错魔芋种，造成生长不适应、品质产量低等现象时有发生，使芋农蒙受了不必要的经济损失[4].

随着测序技术的发展，分子标记手段被越来越多地运用到物种分类鉴定上.其中，SSR分子标记具有共显性、分布广泛、多态性丰富、通用性好等优点，被研究者认为是动植物研究中最强大、信息含量最丰富的分子标记之一[5].目前很多重要作物，如小麦、水稻、玉米、马铃薯、棉花等的SSR标记已被完整开发[5-8].但由于魔芋是相对小众的作物，该属的SSR标记开发相对较少，影响了种质资源的分子鉴定与遗传评价.

我国的魔芋研究主要集中于魔芋的栽培管理、葡甘聚糖的化学特性等方面，对魔芋的分子生物学研究起步较晚[9].目前仅有少量研究利用ISSR、RAPD、AFLP等分子标记，探讨了魔芋部分野生种和栽培品种的亲缘关系[4, 10].但这些分子标记的开发难度相对较大，稳定性较差，不是物种鉴定的最优选项.二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)的发展，为从非模式物种中开发大量分子标记提供了可能.本研究通过滇魔芋的简化基因组测序(restriction site-associated DNA sequencing, RAD-seq)数据开发SSR标记，筛选可在滇魔芋(A.yunnanensis)、西盟魔芋(A.krausei)、东京魔芋(A.tonkinensis)、白魔芋(A.albus)4个物种间通用的SSR引物，并利用SSR分子标记对4个种进行分子鉴定，为魔芋种质资源的栽培利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 样本采集及保存

自2018年以来，对我国魔芋属植株形态接近的4个物种进行了调查采样，共采集到17个种群(图1，表1).采样过程中，对每株魔芋分别取5g叶片，置于-20℃冰箱保存，以备后续的基因组DNA提取.

表1 本研究的魔芋物种群体编号及采样地点

图1 本研究四种魔芋的植株及花形态

1.2 实验步骤

1.2.1 魔芋DNA提取及检测

使用植物基因组DNA试剂盒(天根，北京)提取魔芋叶片的总基因组DNA，DNA提取步骤按照试剂盒规定的操作流程进行.为评估DNA的质量，将提取的基因组DNA用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测.

1.2.2 SSR开发和引物设计

为开发魔芋的基因组SSR标记，从三个滇魔芋种群(SZFHG、BNGD、BMHC)各挑选1个样本(共3个样本)进行简化基因组测序.使用STACKS v 1.47[11]对测序数据进行组装，用MISA软件检测序列中的SSR位点，并使用primer 3设计每个位点的聚合酶链式反应(polymerase chain reation, PCR)扩增引物[12].

1.2.3 魔芋通用SSR标记的筛选

为筛选多态性SSR标记，研究随机选取了105对SSR引物，首先采用25个滇魔芋样本进行多态性SSR标记初筛，样本取自5个种群(SZFHG、BNGD、BMMH、LCYDYL和YSXS)，每个种群选择5个样本.PCR反应体系为30 μL，包括1 ×PCR Mix(Genestar，北京)，0.025 μM的M13加尾的正向引物，0.5 μM 的5’-6-FAM或HEX荧光标记的M13引物，0.5 μM的反向引物和50 ng的模板DNA.扩增采用梯度降落式PCR(Touchdown PCR)方法，经过95℃变性之后，首先将退火温度设置为62℃，然后每循环降低1℃，进行5个扩增循环；然后将退火温度设定为56℃，运行30个扩增循环.随后将得到的PCR产物在ABI 3730XL基因测序仪(Applied Biosystems, USA)进行毛细管电泳分离，并使用GeneMarker2.3(Applied Bioscience)对电泳峰图进行SSR基因分型.

将最终筛选得到的多态性引物在滇魔芋剩余样本中进行群体扩增.此外，为了获得魔芋物种间通用的SSR标记，将多态性良好的引物在西盟魔芋、白魔芋和东亚魔芋中进行样本扩增，PCR扩增及检测条件同上.

1.2.4 基于SSR的魔芋种间分子鉴定

对筛选出的魔芋种间通用的SSR标记，将4个魔芋物种的SSR基因分型数据用GenAlex软件计算各SSR标记的遗传多样性参数，包括等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)和预期杂合度(He)[13].然后利用GenAlex软件计算各群体之间的遗传距离矩阵，并用MEGA软件构建4个魔芋物种间的非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)聚类树[14].

2 实验结果

2.1 基因组DNA质量及简化基因组测序

基因组DNA电泳结果表明，实验中所提取的DNA 条带清晰明亮，没有明显的拖尾现象，DNA 质量较好、纯度较高，满足后续实验的要求(图 2).滇魔芋3个样本的简化基因组测序数据量分别为6.14 Gb、7.35 Gb和5.18 Gb，经过组装，最终获得总长度为184 Mb的组装序列.

图2 部分样本基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 SSR标记开发及引物筛选

在组装基因组中共检测到18,336个SSR标记位点，其中9,005个位点可以顺利设计出PCR引物.对于随机选出的PCR验证的105对引物，73对可成功在滇魔芋群体中扩增出预期条带，其中12对引物显示多态性.这12个SSR位点的重复基序从2碱基到5碱基，PCR扩增片段长度分布在139 bp到324 bp(表2，图3).基于这12个SSR标记对其他3个魔芋种进行了种间通用性检测，结果表明在这12个SSR位点大多数物种内都可以成功扩增(表3).四个物种的分型数据表明，在12个SSR标记中共检测到33个等位基因(Na)，数量从2个(SSR66、SSR14、SSR71、SSR37和SSR96)到4个(SSR13和SSR105)不等，平均数量为2.75个.观察杂合度(Ho)在0.130到0.880之间，预期杂合度(He)在0.055到0.476之间，每个基因座的平均有效等位基因(Ne)在0.711至1.945之间(表4).

表3 筛选滇魔芋多态性SSR引物在其他3个魔芋物的扩增结果

表4 SSR标记的遗传多样性参数

图3 分子标记SSR105部分样本的基因分型图谱

表2 筛选SSR引物信息

基于这12个SSR标记的基因分型数据，对滇魔芋、东京魔芋、西盟魔芋、白魔芋的所有个体样本进行UPGMA聚类分析.结果表明，滇魔芋和东京魔芋可与其他两种区分开来，而西盟魔芋与白魔芋样本之间无法完全分开(图4).

图4 基于SSR分型数据的魔芋4个物种UPGMA聚类树

3 讨 论

3.1 SSR标记对魔芋种质资源鉴定的意义

随着高通量测序技术的发展，SSR标记技术越来越显示出广阔的应用前景.本研究通过RAD-seq开发了数以万计的魔芋基因组SSR标记，相较于传统标记开发手段，本研究无论从时间和经费上均更具优势，这充分表明RAD-seq是一种开发SSR标记的有效手段[15-16].而对于本研究评估的105对SSR引物，有73对(69.5%)可以成功在滇魔芋群体中扩增，这与前人研究中其他植物的PCR扩增成功比例大致相同(60%-90%)[15, 17].此外，本研究筛选出的滇魔芋SSR多态性标记，也在其他3个魔芋种中表现出良好的种间PCR扩增通用性，这些多态性SSR位点将为魔芋的后续的种质资源鉴定与利用提供分子数据.

3.2魔芋SSR标记的种间鉴定

本研究所得到的引物虽然可以将滇魔芋和东亚魔芋从四个物种中鉴定出来，但对西盟魔芋和白魔芋的区分度不足.可能的原因是，首先标记数量过少，本研究总共筛选出12对多态性SSR引物，少量的标记可能无法完全区分魔芋属内的近缘种[18].后续尝试将标记数量增加到20～30个，可能会解决种间区分度不足的问题.其次，有研究认为白魔芋与西盟魔芋的植株及花形态较相似，这两个物种之间可能亲缘关系较近，少量的SSR标记不能反映两者之间的遗传差异[19].基于叶绿体rbcL基因的白魔芋和西盟魔芋的分子系统发育研究也表明，这两个物种之间的遗传变异较低，较短的质体DNA片段无法可靠区分魔芋属内的近缘物种[20].最后，虽然SSR标记在植物基因组中大量存在，变异广泛，相比RAPD、RFLP等分子标记的多态性更高；但SSR标记的一个重要局限就是种间保守性较低，仅能在同一个物种内或属内近缘种间进行扩增[9].本研究的SSR标记是基于滇魔芋的简化基因组数据开发，物种特异性造成了标记在其他三个魔芋物种中的多态性较低，影响了物种的鉴定.

4 结 论

综上，本研究开发得到了魔芋基因组数以万计的SSR标记，这些标记在魔芋种中表现出较好的多态性和种间通用性.系统聚类树表明，这些标记可以用于魔芋属内的物种分子鉴定.后续研究将进一步筛选区分度更好的魔芋种间SSR通用引物，为后续的魔芋种植产业提供辅助.