牡荆素调控NF-κB信号通路在MCAO大鼠中的抗炎、神经保护作用及机制研究

侯芳芳，李向斌

脑卒中是我国人口死亡的第二大原因，同时也是导致成人残疾的首要原因，其中以缺血性脑卒中最为常见。缺血性脑卒中以脑动脉硬化导致的动脉狭窄闭塞、脑组织血流量减少、脑供血不足而引起的脑组织坏死、神经功能损伤为主要表现。其临床治疗以重建微血管循环，尽早恢复血流供应为主[1-3]。然而缺血脑组织血液供应的突然恢复，往往会导致缺血再灌注损伤，使脑组织及其功能进一步受到损害[4]。研究显示，核转录因子-κB(NF-κB)信号通路及其介导的炎症反应与缺血性脑卒中的发生发展关系密切，靶向炎性因子及NF-κB通路已成为近年缺血性脑血管疾病治疗的重要靶点[5]。牡荆素为山楂叶中提取的黄酮类单体成分，具有抗炎、抗氧化、镇痛、神经保护等多种药理学作用，对缺血缺氧性脑损伤具有重要的保护作用[6]。研究表明，牡荆素能够改善缺血缺氧所致的脑组织及神经功能损伤[7-8]。然而其神经保护作用是否与NF-κB信号通路相关尚不明确。本研究通过线栓法建立大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型，观察牡荆素对MCAO大鼠神经损伤的保护作用，并探讨其调控NF-κB信号通路发挥抗炎及神经保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠120只，无特定病原体(SPF)级，体质量(200±20)g，实验前1周于动物房适应性饲养。

1.2 实验药物与试剂 牡荆素(每瓶10 mg)购自合肥七星医药科技有限公司，临用前用生理盐水稀释至所需浓度；尼莫地平(每片20 mg)购自山东新华制药股份有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂购自北京索莱宝科技有限公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；核转录因子κB p65(NF-κB p65)抗体、NF-κB抑制蛋白(IκB)α、NF-κB抑制蛋白激酶(IκK)β、β-actin购自Santa Crutz公司；Trizol 总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与给药 将SD大鼠随机分为6组：正常组、假手术组、模型组、阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组，每组20只。除正常组外，其余各组大鼠建立MCAO模型，牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组分别给予牡荆素5 mg/kg、10 mg/kg灌胃治疗，阳性对照组给予尼莫地平12 mg/kg灌胃给药，假手术组及模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，持续14 d。治疗结束后，每组选取5只大鼠取脑组织，测定脑组织含水量，5只大鼠进行TTC染色，5只大鼠HE染色，余下 5只大鼠进行蛋白质印迹法(Western Blot)及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。

1.3.2 模型建立 采用大脑中动脉线栓法建立MCAO模型[9]。大鼠于术前禁食12 h，经水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后于颈部正中切开1 cm切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，并用4号丝线结扎CCA近心端，微动脉夹将ICA夹闭后，用显微剪在CCA上开一小口，将线栓由CCA插入ICA，再通过 ICA进入大脑中动脉(MCA)，深度至16～18 mm时可有轻微阻力感，随后用4号缝合线结扎CCA和 ICA远心端，缝合切口并用碘伏消毒。假手术组仅分离上述血管而不插栓线。

1.3.3 神经功能障碍评定 参照Longa评分标准对大鼠神经功能障碍程度进行评分[10]：神经行为无异常者计0分；将鼠尾提起时手术对侧前肢内旋，不能完全伸展者计1分；行走时围绕手术对侧转圈者计2分；行走时向手术对侧倾倒者计3分；意识丧失，不能自主行走者计4分。得分1～4分为造模成功，纳入实验，将造模未成功及意外死亡大鼠剔除实验，并按实验条件随机选取大鼠补充。记录治疗结束 24 h后各组大鼠的神经功能评分。

1.3.4 脑组织含水量测定 治疗结束后，将大鼠断头处死，迅速取出脑组织，采用“干-湿重”法测定脑组织含水量，生理盐水冲洗脑组织表面血渍，定性滤纸吸干表面水分后精密称重，即为湿重。然后将脑组织置于60 ℃恒温箱连续烘干72 h，取出后反复称量至2次重量差<0.3 mg，即为干重。计算公式为：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.5 脑梗死体积测定 治疗结束后，将大鼠断头处死后取脑组织，置于-20 ℃冰箱内冷冻20 min，将脑组织沿冠状面每隔2 mm切成均匀的5片，放于避光保存的2%TTC染液中，37 ℃孵育30 min，期间每5 min翻动1次，染色结束用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，4%多聚甲醛溶液固定24 h。正常脑组织为红色，白色或未被染色部分为梗死区域。将大脑切片排列整齐并拍照，Image-Pro Plus 6.0分析软件测量并计算梗死体积。脑梗死体积(%)=脑梗死面积/脑切片面积×100%。

1.3.6 海马组织神经元形态学观察 治疗结束后，大鼠给予水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定后开胸暴露心脏，剪开左心室，将灌注针从左心室插入至升主动脉并固定，灌注4%多聚甲醛的PBS溶液150 mL，1 h后立即取脑组织置于4 %多聚甲醛溶液，于4 ℃冰箱中继续固定72 h，将脑组织沿冠状面切成厚度2 mm的脑片，取含海马脑片进行石蜡包埋，进行HE染色，中性树胶封片，光学显微镜观察海马CA1区神经元形态学变化。

1.3.7 血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量检测 治疗结束后，各组大鼠腹主动脉取血，3 000 r/min离心，分离血清，采用ELISA检测大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α 水平，所有操作均按ELISA试剂盒说明书进行，测定各反应孔OD值后建立标准曲线，计算各样本IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.3.8 Western Blot检测NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的蛋白表达 取大鼠海马组织，置于RIPA裂解液中提取组织总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转膜，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，增强化学发光法(ECL)显影，凝胶成像系统曝光后，用Image J软件进行蛋白定量分析。

1.3.9 RT-PCR检测NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的mRNA表达 取大鼠海马组织，采用Trizol 法提取组织总RNA，紫外分光光度仪测定总RNA浓度，取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA，再进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。扩增条件为 95 ℃变性5 s，退火温度 60 ℃、34 s，扩增40个循环。经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法分析NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的相对mRNA表达。各基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分及脑组织含水量比较 正常组及假手术组大鼠神经功能缺损评分均为0分，模型组大鼠可见明显的神经功能损伤体征；与正常组比较，模型组神经功能评分明显升高(P<0.01)，牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组及阳性对照组神经功能评分均较模型组明显降低(P<0.01)。与正常组比较，模型组大鼠脑组织含水量明显升高(P<0.01)；牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组及阳性对照组脑组织含水量均较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠神经功能评分及脑组织含水量比较(±s)

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 经TTC染色可见，正常组及假手术组大鼠脑组织中均未出现梗死灶，模型组、阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组脑组织均可见不同程度的梗死。阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组脑梗死体积均较模型组明显缩小(P<0.05或P<0.01)。详见表3、图 1。

表3 各组大鼠脑梗死体积比较(±s) 单位：%

图1 大鼠脑组织TTC染色结果

2.3 各组大鼠海马组织神经元形态比较 HE染色可见，正常组及假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐，密度高，未见异常病理学改变。模型组大鼠神经元损伤明显，可见细胞核呈三角形固缩，细胞浆嗜酸性增强，CA1区可见大量坏死神经元。阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组可见坏死神经元数量显著减少，神经元密度较模型组明显增加，神经元形态改善明显。详见图2。

图2 各组大鼠海马组织神经元形态比较(HE染色，×400)

2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量比较 假手术组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α 水平均较正常组明显升高(P<0.01)。阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量均较模型组明显降低(P<0.01)。详见表 4。

表4 各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量比较(±s) 单位：pg/mL

2.5 各组大鼠海马组织NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的蛋白表达比较 假手术组大鼠海马组织中NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的蛋白表达与正常组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠NF-κB p65、IκK-β的蛋白表达较正常组明显增加(P<0.01)，IκB-α的蛋白表达较正常组明显减少(P<0.01)。阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组NF-κB、IκK-β的蛋白表达均较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)，IκB-α的蛋白表达较模型组明显上调(P<0.05或P<0.01)。详见图 3、图4。

图3 各组大鼠海马组织NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的蛋白表达条带图

与正常组比较，＊ P<0.01；与模型组比较，# P<0.05，△ P<0.01。

2.6 各组大鼠海马组织NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的mRNA表达比较 假手术组大鼠海马组织中NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的mRNA表达与正常组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠NF-κB、IκK-β的mRNA表达均较正常组明显增加(P<0.01)，IκB-α的mRNA表达较正常组明显减少(P<0.01)。阳性对照组、牡荆素低剂量组、牡荆素高剂量组NF-κB、IκK-β的mRNA表达水平均较模型组明显降低，IκB-α的mRNA表达水平较模型组明显升高(P<0.01)。详见表5。

表5 各组大鼠海马组织NF-κB p65、IκB-α、IκK-β的mRNA表达比较 (±s)

3 讨 论

脑卒中是我国第二大致死性疾病，同时也是导致成人残疾的首要原因，存活病人中有50%～70%遗留不同程度的运动、言语及认知功能障碍，为病人及其家庭带来沉重经济负担。脑卒中主要包括出血性及缺血性两大病理类型，以缺血性脑卒中较为常见，约占80%[1-2]。缺血性脑卒中是由于脑动脉硬化导致颈动脉及椎动脉狭窄或闭塞，脑血栓形成，局部血流量减少，脑供血不足而出现脑组织缺血性坏死及神经功能损伤的神经系统症状和体征[3]。其临床治疗以重建微血管循环，尽早恢复血流供应为主。然而缺血脑组织血液供应的突然恢复，往往会导致缺血再灌注损伤，使脑组织损伤程度进一步加重[4]。

免疫炎症损伤是介导缺血性脑卒中发生的重要机制，且与病人病情进展及预后密切相关[11]。脑组织缺血损伤后，神经系统中的小胶质细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞等炎性细胞被激活，均可产生并释放促炎因子，这些被释放的炎性因子又能反过来激活炎性细胞，加重脑损伤[12]。研究表明，NF-κB信号通路与缺血脑组织中炎症反应的调控密切相关[5]。NF-κB通路包括 NF-κB、IκB及 IκK。NF-κB是由p50和p65所构成的一个异质二聚体，正常情况下与IκB结合形成三聚体而处于无活性状态[13-14]。IκK-α及IκK-β是调节IκB磷酸化和降解的功能性激酶，能够介导NF-κB的激活。当细胞受到促炎细胞因子刺激时，IκK活化促使IκB发生磷酸化而与p50/p65解离，进而使NF-κB活化，p50/p65转位入核，激活的p65能够诱导IL-6、IL-1β、TNF-α等多种炎性细胞因子的表达[15-17]。炎症反应能够激活NF-κB通路，而活化的NF-κB又能促使促炎细胞因子表达，不断加剧受损脑组织的炎症反应。因此，靶向炎症损伤因子及NF-κB信号通路已成为近年研究缺血性脑血管病防治的一个重要靶点。

牡荆素是从干燥山楂叶中提取分离的一种黄酮类单体，现代药理研究表明，其具有抗炎、抗氧化、镇痛、神经保护等作用，在中枢及周围神经系统中表现出广泛的生物活性，包括抗癫痫、抗老年痴呆、抗记忆损伤、抗神经毒性等，对缺血缺氧性脑损伤也具有重要的保护作用[6]。Min等[7]研究发现，牡荆素能明显抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达，保护缺血缺氧新生大鼠的神经功能及脑组织损伤。Wang等[8]研究发现牡荆素能够通过调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路，改善脑缺血/再灌注损伤小鼠的神经功能及神经元损伤，减轻脑梗死程度。然而，其对缺血缺氧性脑损伤的神经保护作用是否与调控NF-κB信号通路相关尚未明确。

本研究采用大脑中动脉线栓法建立大鼠MCAO模型，通过观察大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积及海马组织形态学变化评价大鼠的脑损伤程度及牡荆素的神经保护作用。结果显示，牡荆素可明显改善MCAO大鼠的神经功能，减轻脑组织水肿，减少脑梗死体积，并改善海马组织神经元形态，提示牡荆素灌胃治疗对MCAO大鼠具有明显的神经保护作用。炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的水平变化能够有效反映脑组织损伤程度，其血清水平可作为临床检验脑缺血神经损伤的标志物[18]。IL-1β是炎症反应的标志物，组织炎症及损伤可使其血清水平迅速升高，其水平亦随缺血性脑卒中病情进展而变化[19]。IL-6是参与炎症反应的细胞因子，研究证实，IL-6在脑血肿形成、脑组织炎性反应及血脑屏障功能破坏等过程中具有重要作用[20]。TNF-α在炎症反应中能够刺激 IL-6、IL-1β等促炎因子的表达，TNF-α水平升高还可诱发神经毒性，从而加速神经元的损伤坏死[21-22]。本研究ELISA结果表明，经牡荆素处理后大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均较模型组明显降低。提示牡荆素可能通过抑制炎性因子的分泌，减缓炎症反应，从而发挥对MCAO大鼠的神经保护作用。Western Blot及RT-PCR分析结果显示，模型组大鼠海马组织中NF-κB、IκK-β的蛋白及mRNA表达水平均较正常组明显升高，IκB-α的表达水平较正常组明显降低，经牡荆素处理后，NF-κB、IκK-β的表达得到有效抑制，同时明显上调了IκB-α的表达。提示牡荆素对MCAO大鼠的抗炎及神经保护作用可能与调控NF-κB信号通路相关。

综上所述，牡荆素能够明显减轻MCAO大鼠脑组织及神经功能损伤，具有良好的神经保护作用，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活，抑制炎性因子表达，减轻受损组织炎症反应有关。