白细胞介素6启动子区基因多态性与肺结核易感性的相关性

尚耀民 胡 旭 周晓蕾 宋文斌 邢宝春

河南省胸科医院 1 结核内科 2 呼吸与危重症科,河南省郑州市 450000； 3 光山县人民医院呼吸与危重症科

肺结核是结核分枝杆菌感染肺部所致，临床以淋巴结肿大、乏力、咯血等为主要症状，严重威胁患者身体健康[1]。多数研究认为，肺结核的发病与宿主、病原的基因变异及环境等多因素相互作用有关，发病机制复杂且存在较大个体差异，推测其易感性与遗传多态性密切相关[2]。近年来，已有部分研究表明白细胞介素(Interleukin，IL)家族成员IL-12、IL-23等基因多态性与其他结核病的易感性密切相关[3]，也有研究发现，IL-6基因多态性与肺炎、肺动脉高压等肺部疾病的发生有关[4-5]，但关于IL-6多态性与肺结核病相关性的研究较为少见。因此，本研究通过检测肺结核患者与正常对照者IL-6基因启动子区-572C/G和-174G/C位点的基因型分布情况，探讨IL-6基因多态性是否与肺结核的易感性相关，为肺结核预防工作的决策提供依据，同时也为结核病的诊疗研究提供一定理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年6月—2021年3月河南省胸科医院收治的肺结核患者115例作为观察组，其中男67例，女48例，年龄21～55岁，平均年龄(35.45±6.08)岁。纳入标准：(1)符合中华医学会《肺结核诊断和治疗指南》中的诊断标准；(2)年龄18～60岁，汉族，常住河南地区；(3)痰培养阳性，肺部有结核样病灶，或痰培养阴性，活动性肺结核样病灶。排除标准：(1)合并其他肺部相关疾病和其他严重器质性病变；(2)免疫功能异常者；(3)临床资料不全者。同时随机选取同期在我院体检的健康人群101例作为对照组，其中男52例，女49例，年龄23～55岁，平均年龄(34.75±5.21)岁。以上所有受试者均为本地区汉族人群且无其他遗传病史。本研究经河南省胸科医院伦理委员会同意，并且所有受试者均对本研究知情同意。

1.2 基因多态性检测 采集所有受试者空腹静脉血5ml，EDTA抗凝，3 000r/min离心10min，收集细胞，根据全血基因组DNA提取试剂盒(美国amresco)说明书提取总DNA，经超微量分光光度计检测DNA样品OD值，OD260/OD280为1.6～1.8合格后置于4℃冰箱保存待用。根据NCBI基因库中IL-6(NC_000007.14:22725889-22732002)基因序列并利用NCBI Primer-BLAST设计PCR引物，IL-6基因启动子区-572C/G位点上游引物：5’-GCTATGGAAGGGTCCTACTCAG-3’；下游引物：5’-ATCCTTTGCAGTGGAGGGATG-3’。IL-6-174G/C位点上游引物：5’-TGCTATGGAAGGGTCCTACTC-3’；下游引物：5’-AATCCTTTGCAGTGGAGGGA-3’，PCR扩增条件：95℃预变性5min，96℃变性30s，60℃ 退火30s、72℃ 延伸15s 共40个循环，室温冷却1min。采用PCR-RFLP检测基因多态性：将纯化后的PCR产物置于37℃恒温箱中，分别加入相应的HinfI限制性内切酶(百奥莱博)进行酶切反应，4h后用2%的琼脂糖凝胶处理酶切产物并在90V电压下电泳30min，溴化乙淀染色，利用凝胶成像系统分析鉴定基因型，并统计两组基因型的分布情况。

1.3 观察指标 收集两组受试者年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、家族史等一般资料；统计受试者基因型及等位基因分布情况。

1.4 统计学方法 本研究采用SPSS21.0对所有数据进行分析，符合正态分布的计量数据以均值±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料以n(%)表示，组间比较采用χ2检验。采用χ2值检验各组基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，采用二元Logistic回归进一步分析基因多态性与肺结核易感性的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组受试者的年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒及家族史情况比较无统计学差异(P>0.05)，但观察组患者接触史比例显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 观察组和对照组的IL-6基因-174G/C、-572C/G位点基因型的实际分布频率和预期频率分布均无统计学差异(P>0.05)，均符合遗传平衡，提示研究对象具有群体代表性。见表2、3。

表2 IL-6-174G/C位点Hardy-Weinberg平衡定律检验

表3 IL-6-572C/G位点Hardy-Weinberg平衡定律检验

2.3 基因多态性与肺结核易感性的关系 两组IL-6-174G/C位点基因型和等位基因分布无显著差异(P>0.05)，-572C/G位点基因型频率无显著差异(P>0.05)，但其等位基因频率比较差异存在统计学意义(P<0.05)。各基因型组内比较，结果显示观察组-572C/G位点CC基因型频率显著升高(χ2=4.186，P=0.041)，见表4和表5。

表4 IL-6-174G/C位点基因型及等位基因频率比较[频数(频率)]

表5 IL-6-572C/G位点基因型及等位基因频率比较[频数(频率)]

2.4 肺结核易感性的二元Logistic回归分析 以是否肺结核(是=1，否=0)为因变量，以一般资料及-572C/G位点基因型为自变量进行二元Logistic回归分析(向前：条件)，其中赋值-572C/G位点基因型CC=1、(CG+GG)=0，结果显示IL-6 基因-572C/G位点CC基因型是肺结核易感性的独立危险因素，见表6。

表6 肺结核易感性多因素二元Logistic回归分析

3 讨论

据统计，约10%的结核分枝杆菌感染者可转化为活动性肺结核，并且发病率随种族、地域的不同而出现显著的差异[6]，提示肺结核的易感性与基因遗传特征具有一定的关联性。近年来，随着对肺结核研究的不断深入，越来越多的研究发现白介素家族IL-37、IL-18、IL-10等多个成员的基因多态性可能与肺结核的易感性有关[7-9]。IL-6是IL家族的重要成员，在炎症、免疫及恶性肿瘤等生理病理过程中均发挥重要作用，其部分多态性位点可能通过影响其表达水平或活性影响疾病的发生进展。研究已证实IL-6参与调节肺结核细胞的免疫反应[10]，但IL-6基因多态性是否与肺结核易感性存在相关性尚不清楚。因此，本研究对IL-6基因-174G/C、-572C/G位点开展研究，初步探讨IL-6基因-174G/C、-572C/G位点多态性与肺结核易感性的相关性。

IL-6是一种多功能的细胞因子，主要由T细胞、B细胞及巨噬细胞等多种细胞分泌产生，具有调节免疫应答、参与炎症反应等作用，与多种疾病的病理过程密切相关。IL-6基因位于7p21染色体上，其蛋白结构由4个α螺旋和C端受体组成。IL-6启动区存在多种单核苷酸多态性位点，-174G/C、-572C/G位点是目前研究领域的热点，关于其与疾病相关性的研究主要集中在心脑血管疾病、炎症感染、免疫性疾病等疾病上[11-12]，而在肺结核等肺部疾病上的研究相对较少。有研究表明IL-6基因-572C/G位点CG及GG基因型是急性脑梗死患者继发肺部感染的独立危险因素[13]；李小莉等进行了Meta分析发现IL-6基因-572C/G位点多态性可能与慢阻肺易感性存在一定的关联[14]；在肺结核的研究中，李洋等的研究表明，中国汉族人群肺结核患者IL-6基因rs2069837、rs1554286位点呈多态性分布，与肺结核感染存在相关性[15]；而早期孙永红分析了汉族人群IL-6启动区-174G/C、-572C/G及-579G/A位点不同基因型与肺结核易感性的关系，结果发现-174G/C、-579G/A位点多态性与肺结核易感性无关，但IL-6-572C/G位点多态性可能与肺结核发病相关，CC基因型可能是肺结核易感性的危险因素[16]；同样汪文斐的研究也表明IL-6-572C/G位点多态性可能与肺结核有关，肺结核组患者的G等位基因频率低于对照组，携带G等位基因可能是肺结核易感的保护因素[17]。但关于IL-6启动子区位点的基因多态性与肺结核易感相关性的研究仍相对较少，结论仍需更进一步的研究加以证实。因此，本研究分析了河南地区汉族肺结核患者与对照人群的IL-6 基因-174G/C、-572C/G位点基因型分布情况，结果显示两组IL-6 基因-174G/C位点基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义，而IL-6-572C/G位点等位基因分布频率存在统计学差异，且肺结核患者-572C/G位点CC基因型分布频率显著高于正常人群(P<0.05)，进一步二元Logistic回归分析发现IL-6-572C/G位点CC基因型是肺结核易感性的独立危险因素(OR=3.846，P=0.011)，与现有研究结果基本一致。但由于本研究样本量少，属于小范围单中心研究，后续还需扩大样本进行多种族的高质量流行病学研究进一步证实。

综上所述，IL-6基因启动子区-572C/G位点多态与肺结核易感性相关，其中CC基因型是肺结核易感性的独立危险因素。本研究结论为肺结核易感人群的早期筛查、预防及制定干预措施提供了一定理论依据。