绞股蓝皂苷对动脉粥样硬化的分子靶点及作用机制*

陈松， 刘云青， 张泽， 李豪， 谢振欣， 梁玺， 张俊， 孙见飞， 吴宁

(贵州医科大学 基础医学院 化学与生物化学实验室， 贵州 贵阳 550025)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是以动脉内膜形成粥糜样斑块为特征的慢性炎症疾病，是动脉硬化性心血管疾病最常见、最重要的病理类型[1]。AS主要累及冠状动脉、主动脉等结构，易造成器官梗死，已成为心血管意外事件的主要因素[2]。有研究表明，细胞凋亡不仅受其基因调控，在很大程度上还受到环境因素影响。血管内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞等AS相关细胞受各种理化因素影响而发生凋亡，其过程影响着粥样斑块的形成和稳定性，是AS的始动因素和关键环节[3]。中医认为，黄芪、水蛭、茯苓、绞股蓝等中草药材的活血、化淤、消积、降脂、通络作用在防治动脉粥样性硬化斑块形成、发展和脱落过程发挥独特功效[4]。绞股蓝为葫芦科绞股蓝属植物，其有效成分由200余种绞股蓝皂苷(gyrenosides, GPs)组成，具有调血脂、降血糖、抗氧化、抗凋亡等作用[5-7]。网络药理学是基于药物生物信息学、分子生物学及各大数据库信息，研究“药物-基因-靶点-疾病”之间关系的一门交叉学科[8]；分子对接技术已成为作用机制预测和活性虚拟筛选的新兴工具，通过此技术可明确配体、受体间相互作用，预测药物机制，为新药开发提供基础。该技术已被广泛应用于药物发现、靶标预测和机制研究等领域[9]。本研究利用网络药理学结合体外试验与分子对接，探究GPs与AS之间的分子靶点与作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 选用40只清洁级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，体质量(210±10)g，由贵州医科大学动物中心提供，合格证编号[SYXF(黔)2018-0001]。

1.1.2药物 GPs粉末，纯度≥98%(陕西中鑫生物有限公司)、辛伐他汀(每片5 mg, 海南海灵制药厂有限公司)、高脂饲料(3%胆固醇、0.2%胆盐、20%猪油、10%白糖及高蛋白饲料，重庆腾鑫公司)、维生素D3注射液(VitD3，海南海灵制药厂有限公司)。

1.1.3主要试剂及仪器 一抗蛋白Bax(Cell Signaling Technology公司)、Bcl-2(Proteintech公司)、Caspase-3(Cell Signaling Technology公司)、彩虹蛋白Marker(北京索莱宝生物科技公司)、水平电泳槽DYY-Ⅲ 31D9(北京六一仪器厂)、Quanity One凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司)。

1.2 研究方法

1.2.1绞股蓝治疗AS的网络药理学及生信分析 (1)绞股蓝有效成分筛选及靶点获取，在中药系统药理学分析平台 (traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)[10]中，参考药代动力学参数，以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准，进行绞股蓝有效成分筛选；在TCMSP数据库及HERB本草组鉴数据库(http://herb.ac.cn/)[11]中获取绞股蓝有效成分靶点，并在UniProt数据库 (https://www.uniprot.org/)[12]对有效成分相关靶点进行基因名的匹配及矫正;(2)AS差异基因筛选，从基因表达综合数据库(Gene expression omnibus database,GEO,https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[13]中获取芯片GSE28829数据，对芯片表达矩阵进行探针注释及去除批次效应后，按照样本临床信息对样本进行临床信息注释，分为早期动脉粥样硬化(early atherosclerotic,EAS)及晚期动脉粥样硬化(advanced atherosclerotic,AAS)组，使用RStudio 4.0.3中“limma”包对其进行差异分析，以P<0.05，|log(foldchange)|>log2(1.5)为标准进行差异基因筛选，并进行可视化。

1.2.2“药物靶点-疾病差异基因”关联分析 将绞股蓝有效成分靶点及AS差异基因交集获得“药物靶点-疾病差异基因”交集基因，并绘制Venn图；将交集基因导入蛋白互作网络分析平台(STRING, https://string-db.org/)[14]获得靶点蛋白互作关系，并使用Cytoscape 3.8.0绘制PPI网络；使用RStudio 4.0.3中"clusterProfiler"包对上述交集基因进行GO富集分析。

1.2.3GPs成分靶点匹配 在绞股蓝有效成分中提取GPs成分及对应靶点，将GPs成分靶点与“药物靶点-疾病差异基因”交集基因进行匹配，进行后续实验验证。

1.2.4造模分组及给药干预 40只SD大鼠随机均分为空白组、模型组、绞股蓝组、辛伐他汀组，适应性喂养1周，将模型组、绞股蓝组、辛伐他汀组中每只大鼠1次腹腔注射VitD3(60万IU/kg)，从第2周开始每2周注射1次VitD3(30万IU/kg)，均按照2 mL/kg给予高脂饲料(3%胆固醇、0.2%胆盐、20%猪油、10%白糖及高蛋白饲料)喂养；空白组大鼠腹腔注射相等量的生理盐水，给予普通饲料喂养。绞股蓝组给予GPs160 mg/(kg·d)，辛伐他汀组5 mg/(kg·d)进行灌胃给药处理，空白组与模型组给予生理盐水10 mL/(kg·d)，连续喂养12周。末次灌胃给药2 h后，随机处死4只大鼠。取出大鼠主动脉，制作切片、HE染色，观察大鼠主动脉根部AS程度，确定造模成功。

1.2.5取材 各组大鼠喂养12周、最后一次灌胃给药后2 h时麻醉处死大鼠，取出主动脉分段放入冻存管于液氮(-183 ℃)中迅速冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存待检测。

1.2.6主动脉HE染色病理切片 将分离的主动脉弓并剪取0.5 cm，生理盐水洗净血迹后放入10%中性甲醛溶液固定，之后进行石蜡包埋，间断切片厚5 μm 、HE染色，在光镜下观察主动脉根部组织及斑块形态。

1.2.7Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达 取出冻存的动脉组织，按组织净重与RIRA裂解液1 ∶10加入PSMF蛋白提取剂，于冰上研磨成匀浆后离心-80 ℃备用。用Wsetern blot法检测蛋白并定量，每个电泳孔上样20 μg蛋白，经10%聚丙烯胺凝胶电泳分离蛋白，并通过转膜电泳将蛋白转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗室温摇床孵育1 h后转4 ℃冰箱过夜孵育。经1×TBST洗涤3次，每次10 min。二抗室温摇床孵育2 h、重复洗涤。经ECL显色液浇淋后曝光显色。利用Imasge J软件测定目的蛋白和内参蛋白β-actin条带灰度值，并用目的蛋白灰度值/内参灰度值的比值表示该目的蛋白表达水平。

1.2.8GPs及Bcl-2、Bax、Caspase-3凋亡蛋白的分子对接 通过文献查阅及绞股蓝有效成分筛选，共选定5种绞股蓝皂苷Gypenoside XXXV_qt、Gypentonoside A_qt、Gypenoside XXVIII_qt、Gypenoside XXVII_qt、Gypenoside XXXVI_qt，将Bcl-2、Bax、Caspase-3与上述活性成分进行分子对接。从 TCMSP 数据库中分别获取以上5种GPs单体的活性成分。从 PDB 数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)中获取Bcl-2、Caspase-3、Bax分子信息，用 Autodock 软件对蛋白质进行去水、加氢、电荷计算等预处理，同时使用Docking输出为Vina Config的txt文件格式。使用记事本打开该txt文件调整参数后，利用Vina软件直接处理txt文件。以导出的 affinity 为打分函数的结果并用pymol进行蛋白质和配体可视化分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 绞股蓝有效成分及靶点筛选

在TCMSP数据库中，按照药代动力学参数，以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准，共筛选获得绞股蓝有效成分24种(表1)。在TCMSP数据库及HERB数据库种检索以上24种有效成分的相关靶点，并在 UniProt数据库对有效成分相关靶点进行基因名的匹配矫正，共获得有效成分靶点152个。

表1 绞股蓝有效成分表Tab.1 Effective ingredients of Gynostemma

2.2 EAS及AAS差异基因筛选

使用RStudio 4.0.3中“limma”包对芯片数据中EAS及AAS组进行差异分析，以P<0.05，|log(foldchange)|>log2(1.5)为标准进行差异基因筛选，共获得差异基因646个，其中438个基因上调，208个基因下调，按照P值降序排列，表2展示了分别位于上调下调基因中前10位的20个基因，并将部分标记在火山图中(图1)。

表2 EAS和AAS差异表达基因(Top10)Tab.2 DEGs in EAS and AAS(Top10)

图1 EAS和AAS差异表达基因火山图Fig.1 Volcano plot showing DEGs in EAS and AAS

2.3 “绞股蓝-动脉粥样硬化差异基因”关联分析

将绞股蓝有效成分靶点与动脉粥样硬化差异表达基因取交集(图2A)，共获得交集基因16个，分别为VEGFA、BCL2、PLAU、MMP9、NFKBIA、ODC1、ICAM1、VCAM1、HSPB1、PLAT、NCF1、SPP1、CTSD、IRF1、PCOLCE、HK2，提取上述交集基因并表达矩阵绘制表达矩阵热图(图2B)。通过STRING数据库获取交集基因连接关系，并使用Cytoscape 3.8.0绘制蛋白互作PPI网络(图2C)，位于互作网络前5位的核心基因为ICAM1、MMP9、NFKBIA、PLAU、VCAM1、VEGFA。GO富集分析分别从生物过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)3个角度对交集基因进行功能注释，“绞股蓝-动脉粥样硬化差异基因”交集基因主要富集在乏氧、氧化、细胞基质黏附、凋亡负向调节等生物过程(图2D)。

注：A为绞股蓝有效成分靶点与动脉粥样硬化差异表达基因交集Venn图，B为交集基因表达矩阵热图，C为交集基因蛋白互作PPI网络图，D为交集基因GO生物过程富集分析气泡图。图2 绞股蓝-AS差异基因关联分析Fig.2 Bioinformatics analysis of Gynostemma-AS DEGs

2.4 GPs靶点匹配

从TCMSP筛选获得的绞股蓝24种有效成分中，共含有11种皂苷成分，分别为Gypenoside XXXVI_qt、Gypenoside LXXIX、Gypenoside XXXV_qt、Gypenoside XII、ginsenoside f2、Gypentonoside A_qt、Gypenoside XXXII、Gypenoside LXXIV、Gypenoside XXVIII_qt、Gypenoside XL、Gypenoside XXVII_qt，将该11种GPs成分的靶点合并去重后，共获得靶点8个NR3C1、AR、BCL2、CCNB1、STAT3、ESR1、NR3C2、NCOA2，其中BCL2为“绞股蓝-AS差异基因”交集基因中的靶点，使用GPs对该靶点进行实验验证。

2.5 大鼠主动脉弓组织学观察

光镜下观察大鼠主动脉弓HE染色切片(400×)，可见空白组大鼠内膜光滑完整，平滑肌层排列整齐，未见明显纤维斑块、胆固醇结晶及粥样斑块形成(图3A)；模型组动脉内膜不平整且增厚，可见泡沫细胞及胆固醇结晶，血管平滑肌增生且排列紊乱轻微(图3B)；通过辛伐他汀或GPs处理干预后的大鼠，可见其病理改变较模型组有不同程度的减轻；辛伐他汀组大鼠主动脉内膜较为完整、增厚，血管平滑肌排列较为整齐(图3C)；绞股蓝组可见内膜较完整，轻度增生，内膜下少量胆固醇结晶，血管平滑肌排列较整齐(图3D)。

图3 各组大鼠主动脉弓组织学变化(HE，×400)Fig.3 Histological changes of rat aortic arches in each group (HE，×400)

2.6 大鼠血管中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达水平

采用Western blot法检测各组大鼠血管中上述3种蛋白的表达量。结果显示(图4)，与空白组相比较，模型组血管Bax、Caspase-3表达水平增高 (P<0.05)、Bcl-2降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，绞股蓝组Bax表达下调(P<0.05)、Bcl-2表达上调(P<0.05)，Bcl-2/Bax表达比值升高，Caspase-3表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：(1)与模型组相比，P<0.05；(2)与空白组相比，P<0.05。图4 各组大鼠血管中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达水平比较Fig.4 Protein expression levels of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in rat blood vessels in each group

2.7 分子对接

Bcl-2、Bax、Caspase-3是AS发生发展中调控细胞凋亡的重要靶点，通过文献及有效成分筛选，本文拟定对接绞股蓝单体分子5个，分别为Gypenoside XXXV_qt、Gypentonoside A_qt、Gypenoside XXVIII_qt、Gypenoside XXVII_qt、Gypenoside XXXVI_qt，将其与上述3个关键靶点进行对接，认为结合能小于-8 kcal/mol的配体-受体具有良好亲和性。结果显示，以上5个单体分子与3个关键靶点均显示出良好的亲和性(表3)；其中Gypenoside

表3 绞股蓝单体与作用靶点分子对接的结果Tab.3 The result of Gypenoside monomer docking with the action target molecule

XXXV_qt对3个靶点的亲和性相较于其他单体而言更高，Gypenoside XXXV_qt与Bax对接结合能为-8.6 kcal/mol、与Bcl-2对接结合能为-9.8 kcal/mol、与Caspase-3对接结合能为-8.0 kcal/mol，提示Gypenoside XXXV_qt可能在抗细胞凋亡中发挥了重要作用。将Gypenoside XXXV_qt对接结果进行可视化展示。见图5。

注：A、B、C依次为Bcl-2、Bax、Caspase-3对接结果。图5 Gypenoside XXXV_qt对接结果三维结构模式Fig.5 Simulation diagram illustrating Gypenoside XXXV_qt docking with its target

3 讨论

在本研究中，基于网络药理学及芯片数据挖掘，探讨了绞股蓝中部分GPs有效对于预防动脉粥样硬化的关键靶标及作用机制。网络药理学能从分子水平对药物、疾病、基因进行系统关联，预测药物靶标。基因芯片的数据挖掘可以从特定角度找到疾病发生发展中基因的差异变化。通过以上两种技术对绞股蓝进行靶点预测，能够更加科学有效地筛选出药物核心成分，有助于进一步的科学研究及临床应用。

绞股蓝常被人们制作为茶类饮品用于预防心血管疾病与糖尿病，GPs则是绞股蓝中的重要提取物，有抗氧化应激、降血糖、抗肿瘤、调节血脂等功效[15]。有研究表明，GPs能显著降低血清中三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平，调节胆固醇合成限速酶HMGGCR，提高高密度脂蛋白胆固醇水平[16]。此外，GPs可以在体内上调超氧化物歧化酶的表达并且降低丙二醛、活性氧的水平，起到抗氧化应激的作用[17]。

本研究通过网络药理学及GEO芯片挖掘得到，绞股蓝与EAS及AAS样本差异基因交集基因16个，其中在BCL2、ODC1、HSPB1在EAS样本中相较于AAS表达量上调。BCL-2蛋白家族是在细胞凋亡内源性途径中发挥关键作用，BCL2编码的Bcl-2蛋白为抗细胞凋亡的重要蛋白，而由BAX编码的Bax蛋白具有其拮抗作用，在正常细胞中Bax蛋白以非活性形式穿梭于细胞质与线粒体之间，在诱导细胞凋亡时，该蛋白聚集并插入线粒体膜中，形成孔状结构，释放促细胞凋亡因子[18]。ODC1编码的蛋白为一类鸟氨酸脱羧酶，是合成多胺途径中的限速酶，负责鸟氨酸脱羧形成腐胺，ODC1常在肿瘤中表达升高[19]，鸟氨酸脱羧酶依赖的腐胺形成，可能促进巨噬细胞对凋亡细胞的清除，有助于炎症缓解[20]。HSPB1也称为Hsp27，该基因编码小热休克蛋白蛋白家族的成员，小热休克蛋白Hsp27是由各种应激因素诱导的多功能蛋白，参与细胞凋亡和自噬的调节，且具有抗动脉粥样硬化作用[21-22]。对上述16个交集基因进行GO富集分析时发现，交集基因主要富集在乏氧、氧化、细胞基质黏附、凋亡负向调节等生物过程。且发现绞股蓝中皂苷有效成分治疗动脉粥样硬化的关键靶点为BCL2。后续实验验证结果也表明，在GPs治疗动脉粥样硬化过程中，可能通过调控细胞凋亡从而缓解动脉粥样硬化进程。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，对机体的内环境平衡及生长发育有着重要影响。在AS的发生发展过程中，平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞均参与其中。动脉粥样硬化斑块的稳定性极大程度取决于斑块纤维帽的厚度及浸润情况，平滑肌细胞凋亡及胶原分解可能导致纤维斑块变薄，增加破裂风险[23]。巨噬细胞凋亡在病变早期具有保护作用，在疾病进展至晚期，巨噬细胞凋亡可能导致清除凋亡细胞能力不足，从而促进炎症浸润及发展[24]。内皮细胞常被认为是AS的始动因素，内皮细胞对于维持血管张力、细胞粘附、抗血小板聚集等正常血管生理功能具有重要作用，当内皮过度细胞凋亡，会损坏该血管屏障，且会释放一些膜结合的细胞外囊泡，从而对AS发生发展产生一定影响[25]。

综上所述，本研究通过网络药理学筛选出GPs与AS相关靶点BCL2，并通过动物实验验证GPs可能通过影响细胞凋亡相关蛋白的表达从而干预动脉粥样硬化的发生发展，同时利用分子对接技术，预测筛选出GPs中最可能影响细胞凋亡的核心成分，结果提示Gypenoside XXXV可能作为GPs影响AS细胞凋亡进展中的关键分子。但本研究对于GPs通过细胞凋亡干预AS的具体探究其作用机制方面有所欠缺，仍有待进一步研究。