香辛料中去甲乌药碱含量分析

郑小敏 尤晓惠 王玮 王美锋 向鹏宇

摘 要：为了解我国56种香辛料中去甲乌药碱的含量范围，通过对不同地区、不同产地、不同品种的香辛料的含量测定，掌握香辛料中去甲乌药碱含量现状。本文对重庆市各大香辛料批发市场及网络平台进行随机采样，采用液相色谱-串联质谱法经Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分离，电喷雾正离子扫描，多反应监测模式检测，同位素内标法对去甲乌药碱进行定性定量分析。结果表明，56个品种中有6种香辛料含有去甲乌药碱，其中，木姜子、月桂叶中去甲乌药碱含量较高;同一品种不同产地的花椒含量存在显著差异;红花椒中去甲乌药碱含量普遍高于青花椒。

关键词：去甲乌药碱;香辛料;高效液相色谱-串联质谱法

Analysis of the Content of Higenamine in Spice

ZHENG Xiaomin， YOU Xiaohui， WANG Wei， WANG Meifeng， XIANG Pengyu

（Chongqing Fuling Institute for Food and Drug Control， Chongqing 408000， China）

Abstract： To understand the content range of higenamine in 56 kinds of spices in China， and to master the content status of higenamine in  different spices from different regions and different producing areas. Random samples were collected from major spices wholesale markets and online platforms in Chongqing. The samples were separated by Waters CSH C18 column （100 mm×2.0 mm， 1.7 μm） by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， electrospray ionization positive ion scanning， and multi-reaction monitoring mode detection. The qualitative and quantitative analysis of higenamine was carried out by isotope internal standard method. The results show that， 6 spices of 56 cultivars contained higenamine， among which， the content of higenamine was higher in the seeds of Zingiberaceae and the leaves of laurel; The content of zanthoxylum from the same variety and different producing areas was significantly different. The content of noraconite in red prickly ash is generally higher than that in green prickly ash.

Keywords： higenamine; spices; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

去甲乌药碱（Higenamine，HG）属于苄基异喹啉类生物碱，是一种β受体激动剂类药物，它能够增加动物心肌收缩力，改善收缩和舒张功能，并具有兴奋心肌细胞、刺激β-肾上腺素受体、舒张血管的作用，因此在临床上可被用作强心剂[1-4]。自2017年起，去甲乌药碱就被国际反兴奋剂组织（World Anti-Doping Agency，WADA）列为S3类（β-2激动剂类）违禁物质[5]。去甲乌药碱主要存在于细辛、黄柏、地肤子[6]、花椒、胡椒、桂皮[7-8]等天然植物中，这些植物正是中药材或日常食用香辛料中的组成部分。因此，运动员极有可能在日常饮食中摄入去甲乌药碱而造成兴奋剂检测阳性检出。本文通过各大香辛料批发市场、农贸市场、中药材市场、商超及网络平台进行采样，采用液色谱-串联质谱法进行不同品种的香辛料中去甲乌药碱的含量分析[8]。

1 材料与方法

1.1 采样

以《天然香辛料 分类》（GB/T 21725—2017）为依据制定采样方案，对重庆市各大香辛料批发市场、中药材批发市场及网络平台进行采样，共采集花椒、辣椒、白胡椒、桂皮、八角、孜然、多香果、草果、高良姜、月桂叶、丁香、荜拨、三奈、香茅草、茴香、芫荽、甘草、砂仁、姜黄、白豆蔻、肉豆蔻、香豆蔻、百里香、芝麻、大蒜、白欧芥、调料九里香、香椿、芒果、杨桃、细叶芹、葫芦巴、留兰香、迷迭香、香荚兰、罗晃子、欧芹、菖蒲、甘牛至、石榴、薄荷、辣根、洋葱、姜、木姜子、小葱、大葱、甜罗勒、莳萝籽、葛縷子、小豆蔻、芹菜籽、龙蒿、牛至、藏红花及大清桂56种香辛料。进行样本分类，每个品种采样量不少于200 g，每种样品不少于3批次;并对含有去甲乌药碱香辛料进行大量采集，覆盖主要产地。

1.2 仪器与设备

Agilent1290-AB 4500 高效液相色谱联用仪（美国AB 公司）;XPE204电子分析天平（梅特勒-托利多），VORTEX3涡旋仪（德国IKA公司），SR-2DS强力振荡器（日本TAITEC公司），Multifuge XIR冷冻离心机（德国ThermoFisher公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标液配制

准确称取去甲乌药碱对照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液;用甲醇逐步稀释成浓度为

1 μg/mL的标准使用液;于-18 ℃冷冻保存。

称取去甲乌药碱-D4对照品1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为

100 μg/mL的内标标准储备液;精密吸取甲乌药碱-D4内标标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，配制成1 μg/mL去甲乌药碱-D4内标标准使用液;于-18 ℃冷冻保存。

1.3.2 样品前处理

本实验采用内标法进行定量分析。样品粉碎均匀，过60目筛，称取试样1.0 g（精确到0.001 g）于50 mL离心管中，加入去甲乌药碱-D4标准使用液100 μL（1 μg/mL），加入19 mL 0.5%甲酸乙醇/水（80+20）溶液，振荡30 min，8 000 r/min离心5 min;提取液转移至20 mL比色管中，用5%氨水调节pH值至8.5±0.5，加水定容至20 mL，混匀。

PBA固相萃取小柱依次用3 mL乙腈、3 mL0.5%甲酸水、3 mL 0.2 mol/L乙酸铵（pH为8.5）活化。取5 mL上述提取溶液，上柱，依次用3 mL 0.2mol/L乙酸铵（pH为8.5）淋洗、3 mL水淋洗;2 mL 0.5%甲酸甲醇洗脱，抽干小柱，收集洗脱液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 0.5%甲酸水复溶，0.22 μm滤膜过滤，上机分析。采用液相色谱-串联质谱法经Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分离，电喷雾正离子扫描，多反应监测模式檢测，同位素内标法定量测定。

1.3.3 仪器条件

（1）液相条件。柱温：40 ℃;进样量：2 μL;流动相A：0.1%甲酸乙腈，流动相B：0.1%甲酸水;

流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源;扫描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测（MRM）模式;电喷雾电压（IS）：5 500 V;雾化气压力（GS1）：

55 psi;辅助气压力（GS2）：55 psi;气帘气压力（CUR）：35 psi;碰撞气体（CAD）：Medium;离子源温度（TEM）：550 ℃。

去甲乌药碱定量离子对：272.0/107.0，去簇电压：40 V，碰撞能量：26 V;去甲乌药碱定性离子对：272.0/255.0，去簇电压：40 V，碰撞能量：20 V;去甲乌药碱-D4离子对：276.0/259.0，去簇电压：40 V，碰撞能量：21 V。

2 结果与分析

2.1 检出限和定量限的测定

将去甲乌药碱标准储备液用甲醇稀释至一定浓度，再分别取适量于10 mL容量瓶中，分别加入适量去甲乌药碱-D4内标标准使用液，甲醇稀释成一定梯度的系列标准溶液按照1.3.3仪器条件进行测定，以去甲乌药碱的浓度与去甲乌药碱-D4浓度比值作为横坐标，以去甲乌药碱定量离子峰面积与去甲乌药碱-D4峰面积比值为纵坐标进行回归分析，去甲乌药碱浓度在0.25～100.00 ng/mL关系良好，相关系数r大于0.999。当S/N≥3作为方法的检出限;S/N≥10作为方法的定量限。各品种方法检出限为

1 μg/kg，定量限为3 μg/kg。

2.2 精密度实验

根据香辛料的使用部位不同，将香辛料分为叶类、果实类、根茎类及花类等，选取甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香及芹菜籽等7种有代表性的不同类型样品进行精密度实验，并分别添加3个不同浓度的标准溶液，每个加标水平设置6个平行样，以考察方法的精密度和回收率，以试剂溶液配制标准曲线，内标法定量。如表2所示，平均回收率范围为92.8%～108.2%，相对标准偏差范围为1.9%～5.6%。

2.3 检测结果

由检测结果可知，花椒、桂皮、荜拨、月桂叶、白胡椒及木姜子等6种香辛料中检出了去甲乌药碱，其中，木姜子和月桂叶中去甲乌药碱含量偏高，见表3。

2.4 花椒中去甲乌药碱的含量分析

本研究中检出去甲乌药碱的其他5个品种产地比较集中，且产量少;而花椒是生活中最常见的食物，是我国主要香辛料之一，也是我国优势特色农产品，产量大，使用范围广，在我国大部分地区都有种植，因此本研究对陕西、四川、重庆、云南和甘肃产地花椒进行采样，共采集样品52批次，分析结果见表4。

各产区主产品种分别是四川（红花椒）、陕西（红花椒）、重庆（青花椒）、云南（青花椒）。通过Excel分别对去甲乌药碱含量进行t检验分析，结果表明，青花椒和红花椒中去甲乌药碱的含量具有显著性差异，红花椒中去甲乌药碱的含量明显高于青花椒。

3 讨论

对56种香辛料中去甲乌药碱进行筛查，其花椒、桂皮、荜拨、月桂叶、白胡椒及木姜子6种香辛料中检出去甲乌药碱，月桂叶和木姜子中含量较高。其中桂皮、荜拨、月桂叶、白胡椒及木姜子在我国的产地相对比较集中。而花椒作为主要的香辛料之一，在我国被广泛种植，各产区主产品种又各不相同，通过采样分析，红花椒的含量明显高于青花椒。

香辛料中去甲乌药碱的筛查和含量测定，对56种香辛料中去甲乌药碱含量有了一个初步了解，本次分析主要针对重庆市各大香辛料批发市场、农贸市场、中药材市场、商超及网络平台进行采样，对香辛料进行摸底，采用液相色谱串联质谱法检测，内标法定量分析测定。其中，6种常用香辛料中检出去甲乌药碱，其余均未检出，提示运动员和心血管患者需特别慎用。

参考文献

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[2]侯平，杨丽，刘宁，等.麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱对大鼠心肌细胞钙离子浓度和细胞膜钙通道的影响[J].中国医科大学报，2013，42（3）：201-203.

[3]王晓霞，韩源.盐酸去甲乌药碱负荷试验在99Tcm-MIBI心肌灌注显像中不良反应的观察[C]//中华医学会第九次全国核医学学术会议论文集.西安：陕西省医学会，2011：124.

[4]陈宝玲，郑英丽，陆直，等.HPLC法测定去甲乌药碱的含量[J].中国新药杂质，2014，13（7）：628-630.

[5]中国反兴奋剂中心.关于加强去甲乌药碱阳性风险防控有关事宜的通知[EB/OL].（2016-11-04）[2022-02-05].https：//www.chinada.cn/contents/6/613.html.

[6]田海峰，衣涛，金东日，等.柱前衍生化高效液相色谱法测定莲子心中去甲乌药碱的含量[J].延边大学学报（自然科学版），2012，38（2）：150-153.

[7]杨明，何思睿，张丹，等.常用药材中去甲乌药碱的LC-MS/MS测定方法研究[J].中国测试，2018，44（3）：61-65.

[8]杨明，陈丹，涂凤琴，等.高效液相色谱-串联质谱测定香辛料中的去甲乌药碱[J].现代食品科技，2020，36（3）：275-280.