不同脂肪来源婴儿配方乳粉与母乳脂质组成的差异分析

林 爽，李晓东,*，刘 璐，张秀秀，李春梅，冷友斌，蒋士龙

（1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150028；3.黑龙江飞鹤乳业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150030）

母乳是新生婴儿最好的能量及营养来源，其中乳脂肪可为0～6 个月婴儿提供所需能量的一半，且为许多必需营养物质的来源，例如：必需脂肪酸、脂溶性维生素和一些生物活性物质等[1]。乳脂肪是由甘油三酯（98%～99%）、磷脂（0.26%～0.80%）以及其他低丰度脂组成。甘油三酯以甘油为骨架，在3 个位置分别酯化3 个脂肪酸，研究显示脂肪酸的种类及位置分布不仅影响乳脂的理化性质，也会影响脂肪的利用率和婴儿的舒适度[2-5]。目前在人乳中发现超过400 种甘油三酯及200 种脂肪酸，并且已经证实脂肪酸的分布并不是随机的，大多数饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）酯化在甘油的sn-2位，且母乳甘油三酯约70%的sn-2位被棕榈酸（C16:0）占据[6-8]。

但由于母亲身体状况、环境因素等限制，无法实现所有婴儿的纯母乳喂养，因此符合婴儿成长阶段的婴儿配方乳粉成了第2选择。为了更好满足婴儿的营养需求，要求婴儿配方乳粉尽量实现脂质组成及结构上的母乳化，目前脂质母乳化主要集中在脂肪酸组成方面，市面上的婴儿配方乳粉多采用油脂复配的方式模拟母乳脂肪酸组成，植物油和牛乳脂是最常见的脂肪来源[9]。此外，还添加一定量的海藻油、鱼油用来补充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）等长链多不饱和脂肪酸（longchain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs）。这使婴儿配方乳粉在脂肪酸的组成方面接近母乳，但仍存在脂肪消化吸收的差异[10]。

现阶段婴儿配方乳粉对母乳脂肪结构的模拟主要体现在1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（1,3-dioleic acid-2-palmitic acid triglyceride，OPO）的应用上，已有很多研究学者表明OPO可以在一定程度上缓解脂肪的消化率和钙吸收较低的问题[2]。但对于母乳中其他含量丰富的甘油三酯研究尚不透彻，对于不同脂肪来源婴儿配方乳粉中脂质的存在形式与母乳的差异也不明确。因此，本研究选取4 种市售的不同脂肪来源的婴儿配方乳粉，通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography triple time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Triple-TOF-MS/MS）、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法对其甘油三酯、总脂肪酸及sn-2位脂肪酸的组成与母乳进行比较研究，分析它们的差异及其可能对脂肪消化产生的潜在影响。旨在为婴儿配方乳粉的设计与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳是由来自哈尔滨的哺乳期志愿者提供的成熟母乳（大于产后21 d，n=6），年龄18～30 岁，分娩足月儿，母乳充足，孕期或哺乳期间无乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、精神系统疾病、癌症及其他恶性消耗性疾病，最近2 周没有使用过药物及催乳用西药。采样时间为上午9—11时之间，在志愿者母亲一侧乳房喂哺婴儿时，用电动人乳采集泵同时采集另外一侧乳房的乳汁，记录母乳的采集时间、乳样质量。母乳采集后保存在10 mL冻存管中，编号后迅速降温至－4 ℃，冷藏状态下运送至实验室，转移至－80 ℃冰箱避光保存。

婴儿配方乳粉选取市售的4 种具有不同脂肪来源的0～6 个月婴儿配方乳粉，包括植物油基婴儿配方乳粉2 种（IF1、IF2）以及牛乳/植物油混合基婴儿配方乳粉2 种（IF3、IF4），具体如表1所示。

37 种脂肪酸甲酯标准品、CNWBOND NH2氨基SPE小柱 上海安谱实验科技股份有限公司；氯仿、甲醇、正己烷、乙腈（均为色谱纯），胰脂酶、牛胆盐 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AB Sciex TripleTOF® 5600＋ Triple-TOF-MS/MS仪美国AB SCIEX公司；LC-30A UPLC仪 日本岛津公司；7000D GC-MS联用仪 美国Agilent公司；Heraeus Fresco17冷冻微量离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；超声仪 深圳雷德邦电子有限公司；UGC-24M氮吹仪 北京优晟联合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取

参考Cheong等[11]的Folch法并加以调整，取冻结母乳于37 ℃水浴融化，并将不同脂肪来源的婴儿配方乳粉（IF1～4）用超纯水分别配制成脂肪质量浓度4.2 g/100 mL的乳液，取5 mL母乳/乳液于50 mL离心管中，加入20 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）和5 mL 0.73% NaCl溶液，混匀后超声提取10 min，室温、5 000 r/min离心10 min，收集下层有机相，在氮气下吹干，制得的脂肪在－20 ℃条件下贮存。

1.3.2 脂肪酸检测

采用酸催化法对乳脂进行甲酯化处理[12]，取30 mg脂肪，加2 mL硫酸-甲醇（1%），60 ℃水浴30 min（每5 min振荡1 次），加入1 mL正己烷并用4 mL纯水洗涤，取上层有机相，加适量无水硫酸钠，离心后用正己烷稀释并加适量的水杨酸甲酯，过0.22 μm有机滤膜后进GC-MS分析。

色谱条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：初始温度50 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升温至220 ℃，并维持20 min。载气为氦气，载气流速1.0 mL/min。进样量10 μL，分流比30∶1。

质谱条件：电子电离源；进样口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃，选择性离子检测扫描方式；电子能量70 eV。

1.3.3sn-2位脂肪酸检测

参考高润颖[13]的方法，用胰脂酶水解甘油三酯获得sn-2单甘酯。取100 mg脂肪，加入2 mL Tris-HCl缓冲溶液、0.5 mL胆酸盐（0.05%）、0.2 mL CaCl2（2.2%）及50 mg猪胰脂酶，振荡混匀，于37 ℃水浴9 min（每3 min振荡30 s），加入1 mL HCl（6 mol/L）溶液终止反应，加2 mL无水乙醚涡旋30 s，离心后取有机相吹干。

参考李兴峰等[14]的固相萃取方法分离sn-2单甘酯，取水解产物溶于二氯甲烷，制成质量浓度为4 mg/mL溶液，将2 mL脂肪-二氯甲烷溶液移入活化好的氨基SPE小柱中，用8 mL正己烷-乙酸乙酯（85∶15，V/V）溶液分4 次洗脱小柱，弃去淋洗液。然后用6 mL二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）分3 次洗出sn-2单甘酯，收集洗脱液用氮气吹干，甲酯化后上样分析。

1.3.4 甘油三酯检测

称取一定质量脂肪，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液复溶，制成1 mg/mL的溶液，过0.22 nm有机相滤膜后进UPLC-Triple-TOF-MS/MS检测分析。

色谱条件：Phenomen Kinetex C18100A色谱柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为水-甲醇-乙腈（1∶1∶1，V/V）（含10 mmol/L乙酸铵）；流动相B为异丙醇-乙腈（1∶1，V/V）（含10 mmol/L乙酸铵）。梯度洗脱：0～1.0 min，80% A、20% B；1.0～6.0 min，80%～20% A、20%～80% B；6.0～10.0 min，20%～5% A、80%～95% B；10.0～12.0 min，5% A、95% B；12.0～20.0 min，5%～80% A、95%～20% B。流速300 μL/min，柱温35 ℃，进样量2 μL。

质谱条件：在控制软件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于信息关联采集功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，采集强度最强且大于100的分子离子对应的二级质谱数据。轰击能量35 eV，每50 ms采集15 张二级谱图。电喷雾离子源参数设置如下：雾化气压60 Pa；辅助气压60 Pa；气帘气压30 Pa，温度550 ℃；喷雾电压5 500 V。

1.4 数据处理

利用Qualitative Navigator B.08.00对GC-MS数据进行提取；利用PeakView 2.2软件分析甘油三酯组成；使用Excel对提取的数据进行预处理，使用SPSS 23.0和Simca 14.1软件对数据进行差异分析和多变量统计分析。所有实验均进行6 次平行测定，结果以表示。

2 结果与分析

2.1 婴儿配方乳粉与母乳的脂肪酸组成分析

2.1.1 婴儿配方乳粉与母乳总脂肪酸组成

如表2所示，共检测出27 种脂肪酸，母乳中含量最高的3 种脂肪酸依次为油酸（C18:1，（36.3±1.24）%）、亚油酸（C18:2，（26.28±0.05）%）和棕榈酸（C16:0，（19.13±1.03）%），该结果与Chen等[15]的研究结果一致，而4 种不同脂肪来源婴儿配方乳粉中含量最高的脂肪酸分别为油酸（34.42%～41.32%）、棕榈酸（21.80%～27.16%）、亚油酸（15.69%～19.19%），且4 种婴儿配方乳粉中亚油酸的含量都显著低于母乳（P＜0.05）。

表2 不同脂肪来源的婴儿配方乳粉与母乳的总脂肪酸组成Table 2 Total fatty acid composition of infant formula with different fat sources and human milk

就SFAs含量而言，4 种婴儿配方乳粉都显著高于母乳（P＜0.05），同时没有在植物油基IF1、IF2中检测到短链脂肪酸，而牛乳/植物油混合基IF3和IF4中短链脂肪酸的含量显著高于母乳（P＜0.05），这是由于天然植物油中几乎不含有短链脂肪酸，而牛羊等反刍动物由于瘤胃中微生物的发酵作用，使乳脂中含有更多的短链脂肪酸[16-17]，人乳中的短链脂肪酸具有调节婴儿脂质代谢，降低肥胖风险，保护和促进肠道成熟等作用[18]。对于MC-SFAs，IF1和IF2的含量明显高于IF3、IF4和母乳（P＜0.05），尤其是辛酸（C8:0，0.75%～1.00%）和月桂酸（C12:0，5.55%～8.11%），这可能是由于IF1和IF2添加了较多富含中链脂肪酸的椰子油。与长链饱和脂肪相比，中链脂肪酸对胆汁盐的依赖性小，可通过胃肠黏膜直接吸收，因此可以快速供能，更符合早产儿及患有吸收不良婴儿的能量需求[19-20]。此外，中链脂肪酸也具有抗菌和抗病毒的特性[21]，在保护婴儿免受有害微生物侵害的同时，对婴儿早期肠道菌群的建立也有一定的影响[22-23]。但如果中链脂肪酸食用浓度过高，会阻止婴儿对其他必需脂肪酸的利用，并产生对某些器官有潜在毒性的代谢物[24]，因此婴儿配方乳粉在脂肪调配过程中要注意浓度。4 种婴儿配方乳粉LC-SFAs的含量与母乳差异不大，且都含有较高的棕榈酸，IF3和IF4尤为明显，这也从侧面验证了牛乳中棕榈酸的高含量[25]。

就MUFAs而言，4 种婴儿配方乳粉与母乳差异不大，都具有高含量的油酸。对于PUFAs的含量，母乳显著高于4 种婴儿配方乳粉（P＜0.05），本质原因在于母乳中含有更多的亚油酸，这也表明婴儿配方乳粉应该适量上调亚油酸的添加量。值得注意的是IF2和IF3中没有检测到亚麻酸（C18:3），而亚麻酸作为一种必需脂肪酸是合成DHA等ω-6 LC-PUFAs的前体[26]，对婴儿大脑和视力都具有重要作用，且亚油酸和亚麻酸的比例还会影响LCPUFAs的内源性合成，GB 10765—2010《准婴儿配方食品》中规定婴儿配方乳粉中亚油酸/亚麻酸的比值范围为5∶1～15∶1，可根据此比例确定婴儿配方乳粉中亚油酸和亚麻酸的添加情况。此外，可以看出4 种婴儿配方乳粉都有补充ARA、DHA等LC-PUFAs，说明LC-PUFAs对婴儿的功能特性已经广泛被大家所接受和认可。

总体看来，目前婴儿配方乳粉可以较好的模拟母乳脂肪酸的大体组成，满足婴儿基础的能量需求。但除了脂肪酸组成之外，其位置分布也对脂质的消化吸收有重要的影响。

2.1.2 婴儿配方乳粉与母乳sn-2位脂肪酸组成

由于胃肠脂肪酶具有位置选择性，特异性水解甘油三酯的sn-1,3位，生成sn-2单甘酯和游离脂肪酸，如果游离脂肪酸中含有过多的LC-SFAs，就容易与婴儿胃肠中的钙镁离子结合，生成不溶性的“钙皂”，从而在降低脂肪和钙吸收率的同时增加婴儿的粪便硬度，降低婴儿胃肠舒适度。而sn-2单甘酯以特殊的机制重新形成甘油三酯后被利用，因此LC-SFAs分布在甘油三酯的sn-2上，就可以减少“钙皂”的产生，提高脂肪和钙的利用率及婴儿的舒适度，有利于婴儿的生长发育[27]。母乳脂肪具有特殊的脂肪酸分布，如表3所示，接近70%的SFAs酯化在母乳甘油酯的sn-2位上，这有利于婴儿对脂肪和钙的吸收，其中含量最高是棕榈酸，母乳中一半以上的棕榈酸（（51.69±0.97）%）酯化在sn-2位上。相比之下，4 种婴儿配方乳粉sn-2位SFAs的含量显著低于人乳（P＜0.05），与IF1（（19.18±1.58）%）和IF2（（22.12±2.02）%）相比，添加了OPO结构脂的IF3（（54.81±1.62）%）和IF4（（54.08±1.48）%）与母乳间sn-2位SFAs及sn-2位棕榈酸的含量差距明显更小，但仍然没有达到母乳水平。

表3 不同脂肪来源的婴儿配方乳粉与母乳的sn-2位脂肪酸组成Table 3 sn-2 Fatty acid composition of infant formula with different fat sources and human milk

4 种婴儿配方乳粉中sn-2位MUFAs和PUFAs的含量都明显高于人乳（P＜0.05），尤其是未添加OPO结构脂的IF1（（80.83±2.62）%）和IF2（（77.88±1.84）%），其中占比最高的为油酸（52.70%～52.95%）和亚油酸（22.92%～26.30%）。总脂肪酸中IF1、IF2油酸的含量接近母乳，亚油酸的含量低于母乳，而在sn-2位脂肪酸中IF1和IF2油酸与亚油酸的含量都显著高于母乳（P＜0.05），说明它们与母乳的脂肪酸位置分布存在很大差异。此外植物油基IF1和IF2含有更高比例的sn-2位中链脂肪酸，尤其是月桂酸，而IF3、IF4和母乳含有较高比例的长链脂肪酸，这也说明不同脂质来源不仅对婴儿配方乳粉脂肪酸组成有一定影响，也会影响脂肪酸的位置分布。相比之下，以牛乳脂为部分脂肪原料的婴儿配方乳粉（IF3、IF4）在脂肪酸位置分布上明显更加接近母乳。同时由表3可以看出，很多母乳中的sn-2位脂肪酸（C11:0、C13:0、C20:0、C23:0、C20:5等）并没有在4 种婴儿配方乳粉中被检测到，这也侧面反映了母乳脂质组成的复杂性。

2.2 婴儿配方乳粉与母乳的甘油三酯组成测定结果

2.2.1 婴儿配方乳粉与母乳的甘油三酯组成分析

由于本研究采用的UPLC-Triple-TOF-MS/MS不能分离同分异构体，所以表4中甘油三酯上的脂肪酸为随机排列，不显示位置特异性。由表4可知，共检测出87 种甘油三酯，母乳中含量最丰富的为OPL（（15.37±1.40）%）和OPO（（14.56±1.40）%），这与之前的研究结果一致[28-30]，与西方母乳中OPO含量最高不同的是，中国母乳中含有更多的OPL，这可能与西方普遍食用橄榄油，而中国普遍食用富含亚油酸的大豆油有关，也进一步验证了饮食习惯对母乳脂肪组成的影响。其他含量较高的依次为LPL（（8.91±0.91）%）、POS（（5.59±0.84）%）和OOL（（4.89±0.75）%）等富含不饱和脂肪酸的甘油三酯，这更加适合婴儿对脂肪的消化吸收。母乳中接近23%的甘油三酯为中长链甘油三酯，其兼具中链甘油三酯和长链甘油三酯的优点，可以平稳的释放脂肪酸，并避免有毒代谢物的产生，且中长链甘油三酯水解产生的单甘酯也被证明具有很强的抑菌、抗病毒的活性[31-32]。

表4 不同脂肪来源的婴儿配方乳粉与母乳的甘油三酯组成Table 4 Triglyceride composition of infant formula with different fat sources and human milk

续表4

4 种不同脂质来源的婴儿配方乳粉都含有较高的OOO（4.58%～8.22%）、LLL（5.08%～7.98%）、OLL（5.47%～8.56%）和PPO（3.78%～8.70%），明显高于它们在母乳中的含量（分别为（3.43±0.32）%、（2.60±1.14）%、（3.37±1.19）% 和（2.47±0.46）%）（P＜0.05），这些甘油三酯主要由油酸和亚油酸组成，说明婴儿配方乳粉中油酸和亚油酸的存在形式与母乳有很大的不同，由sn-2位脂肪酸组成分析可知，在婴儿配方乳粉中，尤其是植物油基的IF1和IF2中，油酸和亚油酸更多的占据在甘油三酯的sn-2位，而它们在母乳中大多数分布在sn-1,3位。由于牛乳/植物油混合基IF3和IF4补充了一定量的OPO结构脂，因此在OPO含量上，相比于IF1（（4.99±1.33）%）和IF2（（4.13±0.48）%），IF3（（9.58±1.11）%）和IF4（（7.53±0.39）%）更接近母乳，但仍存在着较大的差距。同时，在OPL和LPL含量方面，4 种婴儿配方乳粉都远没有达到母乳的水平，由Chen等[33]的研究结果及sn-2位脂肪酸组成分析可知，OPL、LPL同OPO一样富含sn-2棕榈酸，可以降低婴儿粪便硬度，促进脂肪和钙的吸收，因此未来婴儿配方乳粉在进一步提高OPO含量的同时，也应注意对母乳OPL、LPL的模拟。另外，从表4可以看出，4 种婴儿配方乳粉都含有较高的中链甘油三酯，例如：CaLaM、CyLaLa、CaMM等，尤其是IF1和IF2，总含量高达20%，明显高于母乳（（2.18±0.33）%）（P＜0.05），但在中长链甘油三酯含量上，却明显低于母乳（P＜0.05），这对婴儿日后的成长是否会产生影响目前尚不清楚，需要进一步的探究。另外，母乳含有较多富含超LC-PUFAs（如C20:4、C22:6）的甘油三酯，而婴儿配方乳粉中含有较多富含超LC-SFAs（如C20:0、C22:0）的甘油三酯，这种特性在额外添加乳油的IF4中尤为明显。

2.2.2 婴儿配方乳粉与母乳甘油三酯组成的差异分析

为进一步明确不同脂质来源的婴儿配方乳粉与母乳在甘油三酯组成上的差异，对表4中不同乳样甘油三酯的组成进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），表征不同脂质来源婴儿配方乳粉与母乳甘油三酯的组成差异。并筛选变异权重参数值（variable importance in projection，VIP）大于1且P值小于0.05的甘油三酯作为不同样品的差异脂质。

如图1所示，所有样本点表现出明显的聚类趋势，未发现离群样本点，说明建立的OPLS-DA模型对30 个样品进行有效分类，同时模型的Q2=0.961，说明建立的OPLS-DA模型稳定性较好。

图1 不同脂质来源婴儿配方乳粉及母乳甘油三酯组成的OPLS-DA图Fig.1 OPLS-DA model score chart of triglycerides in infant formula with different lipid sources and human milk

由图1可知，母乳与4 种婴儿配方乳粉形成了明显区分，表明不同脂质来源的婴儿配方乳粉在甘油三酯组成上均与母乳存在较大差异。其中植物油基的IF1和IF2较为接近，牛乳/植物油混合基的IF3和IF4较为接近，这说明不同脂质来源对婴儿配方乳粉的甘油三酯组成影响十分明显。将不同脂质来源婴儿配方乳粉与母乳的差异甘油三酯列于表5，共16 种。

表5 不同脂质来源婴儿配方乳粉与母乳差异脂质种类Table 5 Differential triglycerides between infant formula with different lipid sources and human milk

为了更具体了解差异甘油三酯在婴儿配方奶粉和母乳中含量差异，通过绘制热图和层次聚类分析，对其分布进行表征，结果如图2所示。图颜色由蓝色到红色，代表含量由低到高。

图2 差异甘油三酯在不同脂质来源婴儿配方乳粉及母乳中的分布Fig.2 Distribution of differential triglycerides in infant formula with different lipid sources versus human milk

图2进一步表明了不同脂质来源婴儿配方乳粉与母乳甘油三酯组成存在显著差异，与4 种婴儿配方乳粉相比，母乳中OPL、OPO、LPL及以LaPL为代表的中长链甘油三酯明显更高，同时结合前文母乳sn-2棕榈酸含量超过50%这一结果，可以对母乳脂质的高消化吸收率进行解释。IF1和IF2含有较多的OOO、OLL及中链甘油三酯，这是植物油基婴儿配方乳粉的显著特征。添加了牛乳脂的IF3和IF4中差异甘油三酯的普遍含量介于IF1～IF2和母乳之间，说明乳脂的添加可以略微弥补混合植物油的不足，缩短与母乳脂质组成的差距，但需要注意的是在LaPL、CaML等中长链甘油三酯含量上，牛乳/植物油混合基IF3、IF4与母乳的差异仍很大，因此在未来婴儿配方乳粉的设计上需着重注意中长链甘油三酯的模拟。

3 结论

4 种不同脂肪来源的婴儿配方乳粉与母乳脂质组成均存在较大差异，尤其在sn-2位脂肪酸分布和甘油三酯组成方面。OPO结构脂的应用在一定程度上可以缩短婴儿配方乳粉与母乳脂质组成的差距，但效果有限，因此还应对母乳中其他高含量的甘油三酯进行模拟，如OPL、LPL、LaPL等。同时脂肪来源的不同会显著影响婴儿配方乳粉的脂质组成，与植物油基相比，牛乳/植物油混合基婴儿配方乳粉在脂质组成上更加接近母乳，可能更适合作为新生婴儿的能量来源。