超高效液相色谱-高分辨质谱快速筛查和确证凉茶中56 种非法添加药物

刘桂联，陈 茹，罗小宝，陈均正，朱嘉仪

（1.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；2.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；3.广东省质量监督食品检验站，广东 广州 511442）

凉茶是岭南人民根据本地的水土和气象等特性，用独特的研制方法将天然中草药熬制成具有清热解毒、生津祛火等功能的植物性饮料[1]，在岭南人民日常生活中发挥重要作用。但在凉茶销售过程中，有不法商家为增加功效，在凉茶中非法添加西药，若大量或长期饮用，可能会出现重复用药或过量用药现象，甚至产生药物相互作用，导致药品不良反应发生。最近有不少媒体报道在凉茶中检出西药成分[2-3]，部分市区开展的食品安全专项行动中也有发现多家凉茶商铺存在非法添加西药的情况[4]，可见凉茶中含有非法添加药物的现象时有发生。因此，有必要对凉茶市场进行有效监管。近年来应用于凉茶等保健食品中非法添加药物的检测方法不断提高，从常用的液相色谱[5-7]，到液相-质谱联用技术[8-10]，再到超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术[11-15]等。四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱是高分辨质谱中的一种，具有可同时获得高分辨率和高灵敏度的特点，单次采样可获得高通量的数据，并可提供精确一级母离子和精确二级碎片离子，在进行快速筛查、定性确证的同时，可完成定量分析，具有传统三重四极杆质谱无法比拟的优势[16-18]。目前，超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪已经广泛应用于食品[19-20]、药品[21-23]、安全[24-25]、环境监测[26]、司法毒物[27-29]等众多领域当中。但由于超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪存在设备昂贵，需具备较高的专业技术水平等特点，在大部分领域的应用仍处于发展阶段，其分析的对象由单一组分逐步向多物质多组分转化，分析时长和效率也逐步提高[11,13,16]。目前，针对多种功能功效的凉茶同时进行多种非法添加药物筛查的报道仍然少见。

本实验采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术，利用抗炎、止咳、降脂、降压类共56 种药物，通过采集保留时间、精确一级母离子、精确二级碎片离子等质谱信息建立高分辨质谱快速筛查数据库，针对宣称具有下火、防感冒、止咳、减肥、降压等功效的凉茶，进行非法添加药物筛查。该方法具有快速、高通量、准确度高等特点，可同时进行筛查、确证和定量分析等优点，可用于凉茶非法添加药物的快速筛查和确证，是打击凉茶中添加非法物质的有效手段，可为食品安全监管相关部门提供方法依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凉茶购于广东省各市、各地区凉茶店。

56 种标准物质对照品（纯度均大于95%） 中国食品药品检定研究院；甲醇（LC/MS级） 德国默克公司；甲酸（LC/MS级） 赛默飞世尔科技有限公司；甲酸胺（色谱级，纯度≥99.0%） 阿拉丁试剂有限公司；超纯水制备装置（电阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃）美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

Q-Exactive四极杆-静电场轨道肼高分辨质谱仪（配有加热电喷雾电离源）、Vanquish超高效液相色谱仪赛默飞世尔科技有限公司；KQ-500E超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取凉茶样品适量，摇匀，准确吸取1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇35 mL，超声提取15 min，放冷至室温后，用甲醇定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。或根据实际浓度用甲醇适当稀释至线性范围内，作为供试品溶液。

1.3.2 色谱条件

Accucore RP-MS色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流动相：A为0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸铵）溶液；B为0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸铵）甲醇溶液；流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量：1.0 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～6.0 min，95%～2% A、5%～98% B；6.0～7.0 min，2% A、98% B；7.0～8.0 min，2%～95% A、98%～5% B；8.0～10.0 min，95% A、5% B。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源（正离子模式）；扫描模式为全扫描-数据依赖二级扫描模式（Full MS/dd MS2）；鞘气流量40 arb，辅助气流量10 arb；喷雾电压5 kV；离子传输管温度325 ℃，辅助气加热器温度375 ℃；一级扫描范围m/z100～1 500；一级扫描分辨率70 000；一级自动增益控制值为2×105；二级扫描分辨率17 500；二级自动增益控制值为1×105；归一化碰撞能为40、50、60。

1.4 数据统计及图表绘制

数据统计和处理采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪配备的TraceFinder 4.0数据处理系统，图表绘制采用SciDAVis软件。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择与色谱条件优化

选取常用提取溶剂水、50%甲醇、甲醇、乙腈，以各个化合物的色谱峰分离情况、峰响应强度、基线等考察不同溶剂的提取效果。经过对比发现，使用甲醇作为提取溶剂时，56 种化合物都能够获得良好峰形，并且色谱峰响应值较高，基线相对平稳，最终选择使用甲醇作为提取溶剂。在流动相种类方面对比使用水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸铵）-含0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸铵）甲醇作为梯度洗脱溶剂，考察不同流动相组成对56 种化合物的洗脱能力。甲酸和乙酸铵的加入有利于目标物的离子化，当采用0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸铵）-含0.2%甲酸（含2 mmol/L乙酸铵）甲醇作为洗脱溶剂时，离子化效果更佳，各组分能够获得较好的分离效果，出峰时间分布合理，且色谱峰峰形良好。在色谱柱选择方面分别采用Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）、Cortecs C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Accucore RP-MS色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）进行考察，结果发现使用Accucore RP-MS色谱柱时，各目标组分具有较好分离效果，特别是对3 组同分异构体（麻黄碱和伪麻黄碱、那莫西地那非和伪伐地那非、豪莫西地那非和伐地那非）具有较好分离效果、且能获得较好的峰形和较低的柱压，结果见图1，最终选择采用Accucore RP-MS色谱柱作为分析柱。

图1 不同色谱柱分离效果Fig.1 Separation efficiencies of different chromatographic columns

2.2 快速筛查数据库的建立

将质量浓度为100 μg/L的56 种化合物标准溶液注入高分辨质谱仪，利用全扫描-数据依赖二级扫描模式采集数据，收集56 种化合物的保留时间、一级精确分子质量、二级碎片精确分子质量等信息，结合化学式、二级离子强度，利用TraceFinder软件构建高分辨快速筛查数据库。56 种化合物的质谱信息见表1，56 种化合物的提取离子图见图2。

图2 56 种化合物的提取离子图Fig.2 Exacted ion chromatograms of 56 analytes

表1 56 种化合物的质谱信息Table 1 Mass spectral information of 56 analytes

续表1

2.3 方法的线性范围、检出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ）结果

采用空白样品溶液配制系列标曲，利用待测组分峰面积和质量浓度绘制标准曲线，在2～100 μg/L范围内线性关系良好，线性相关系数（R2）均大于0.99。以3 倍信噪比确定方法的LOD，56 种化合物LOD范围为0.5～2.5 μg/L；以10 倍信噪比确定方法的LOQ，56 种化合物LOQ范围为1.5～8.0 μg/L，结果见表2。

表2 方法的线性回归方程、LOD和LOQTable 2 Regression equations with correlation coefficients,LODs and LOQs of the developed method

续表2

2.4 方法的准确度和精密度结果

在空白凉茶样品中分别添加0.5、1.0、2.5 mg/L，采用3 个水平，每个水平进行3 次重复加标回收实验，考察该方法的准确性和精密度，结果如表3所示，平均回收率在90.4%～105.0%之间，相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）不大于6.0%，说明该方法具有较好的准确度和精密度。

表3 方法的准确度和精密度（n=3）Table 3 Recoveries and RSDs of 56 analytes spiked into blank matrix sample (n =3)

2.5 实际样品的测定结果

应用建立的检测方法和数据库，对购买于广东省各市、各地区共195 个批次凉茶样品进行非法添加药物筛查，其中筛查结果阳性样品共6 个批次，均筛查出麻黄碱和伪麻黄碱，其非法添加量在2 127～103 68 μg/L之间，非法添加筛查阳性率为3.1%，其余非法添加组分暂未检出。麻黄碱和伪麻黄碱均具有解热发汗、止咳平喘等药理功效，能够有效缓解感冒、咳嗽的症状[30]，本次筛查阳性凉茶样品均为感冒茶、化痰止咳茶，非法添加药物的药理功效与本次筛查阳性的凉茶样品所宣称的功效具有一致性。阳性样品中麻黄碱和伪麻黄碱的提取离子色谱及质谱图见图3。

图3 阳性样品中麻黄碱和伪麻黄碱的提取离子色谱图（A）及麻黄碱（B）、伪麻黄碱（C）二级质谱图Fig.3 Exacted ion chromatograms (A) and MS2 spectrum of ephedrine (B) and pseudoephedrine (C) in positive samp

3 结论

应用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术，通过建立抗炎、止咳、降脂、降压类共56 种药物的高分辨快速筛查数据库，在10 min内可同时进行56 种物质的快速筛查分析和定量分析，可有效缩短分析时间，提高工作效率。以凉茶为研究对象，优化了样品前处理方法和色谱条件，对该方法的LOD、LOQ、回收率等进行方法学考察。对多批次凉茶样品中56 种非法添加药物进行定性筛查分析和含量测定，发现部分样品筛查出麻黄碱和伪麻黄碱，结果提示，市场中凉茶类商品含有非法添加物质的现象仍然存在，以常见的感冒茶、止咳茶为主。为了给消费者提供健康有利的消费环境，打击非法添加的市场乱象，有必要利用先进的分析检测手段，对凉茶市场进行长期有效的监管。