市售鱼加工食品中3 种晚期糖基化终末产物分析及与组分的相关性

安 婧，张 琪，于 楠，周鹏程，曾名湧，董士远

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）是糖类与蛋白质、氨基酸等经美拉德反应形成的一类复杂化合物总称。AGEs种类众多，广泛存在于生物体与食品中。研究发现，膳食中AGEs是体内AGEs积累的重要来源，其AGEs在体内积累与糖尿病、阿尔兹海默症、帕金森综合征等慢性疾病密切相关。目前，已对食品中代表性AGEs——羧甲基赖氨酸（N-carboxymethyllysine，CML）开展广泛研究，而对羧乙基赖氨酸（N-carboxyethyllysine，CEL）、甲基乙二醛氢咪唑酮（N-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine，MG-H1）等其他AGEs的研究已成为近年来研究热点。

食品中AGEs形成与其组成成分、加工工艺等密切相关。Assar等发现牛肉中CML含量随热处理程度的增加而增加；Tavares等发现干热加工对AGEs形成的促进作用高于湿热加工。Goldberg等发现脂肪和蛋白含量高的食物中AGEs含量较高，而由碳水化合物组成的食物（淀粉、蔬菜、水果）AGEs含量较低。鱼加工食品在烘烤、煎炸等高温加工中易促进AGEs的形成。然而，目前国内尚缺乏针对市售鱼加工食品中AGEs含量方面的研究。分析市售鱼加工食品中AGEs水平，有利于提升其安全水平。因此，本研究尝试建立鱼加工食品中3 种AGEs含量的超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）检测方法，使用该方法分析65 种市售鱼加工食品的AGEs含量及组成成分，揭示其AGEs含量与组成成分的关系，为探究鱼加工食品AGEs含量检测与限量标准建立提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用鱼加工食品均购于青岛台东沃尔玛购物中心。

CML、CEL、CML-、CEL-标准品 加拿大Toronto Research Chemicals公司；MG-H1标准品 美国International Laboratory公司；MG-H1-标准品 美国Bioberry公司；其他试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC仪、Xevo TQ-S MS仪、ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Atlantis HILIC Silica（2.1 mm×100 mm，3 μm）、Symmetry C（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）美国Waters公司；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器昆山超声仪器有限公司；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司；BCD-190TMPK冰箱青岛海尔股份有限公司；DHG-9036A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；LC-CQ-24F固相萃取装置 上海力辰邦西仪器科技有限公司；N-20多功能氮吹仪 山东云网科技有限公司；8400全自动凯氏定氮仪瑞典福斯公司；SXT-06索氏提取器 上海洪纪仪器设备有限公司；Synergy H4酶标仪 美国Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 样品分组

选取市场上代表性烘烤类、油炸类、罐头类和干制类等65 种鱼加工食品，置于－20 ℃保存。

1.3.2 AGEs含量测定

1.3.2.1 样品前处理

将约300 g鱼加工食品粉碎并混合均匀，称取20 mg待分析样品加入0.2 mol/L硼酸盐缓冲液和2 mol/L硼氢化钠溶液，4 ℃条件下还原8 h；加入6 mol/L HCl溶液后110 ℃水解24 h；烘干复溶后加入CML-、CEL-、MG-H1-标准品溶液，过滤膜后进行固相萃取（用甲醇和体积分数2%甲酸溶液依次活化MCX柱，待测液过柱后用2%甲酸溶液和甲醇依次除杂，用5%氨水-甲醇洗脱目标化合物）；氮吹至近干，复溶，过滤膜，待测。

1.3.2.2 标准溶液配制及标准曲线绘制

分别称取CML、CEL、MG-H1、CML-、CEL-、MG-H1-标准物质各5 mg（精确至0.001 mg），用超纯水配制5 μg/mL标准储备液于－20 ℃冰箱保存。配制3 种AGEs内标溶液，质量浓度均为50 ng/mL，绘制0～200 ng/mL范围内标准曲线。

1.3.2.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；进样量3.0 μL；流速0.3 mL/min；流动相：0.25 mol/L乙酸铵和体积分数1%甲酸溶液为A相，乙腈为B相；梯度洗脱程序：0～1.0 min，15% A、85% B；1.0～6.5 min，15%～35% A、85%～65% B；6.5～9.0 min，35% A、65% B；9.0～10.0 min，35%～15% A、65%～85% B。

1.3.2.4 MS条件

离子源：电喷雾离子源正离子模式；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压30 V；脱溶剂气温度450 ℃；离子源温度150 ℃；脱溶剂气流速850 L/h；锥孔反吹气流速150 L/h；碰撞气流速0.12 mL/min；采集模式：多反应监测；CML、CEL、MG-H1的定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表1。

表1 AGEs多重反应监测采集参数Table 1 Multiple reaction monitoring mass spectrometric parameters for analysis of AGEs

1.3.3 蛋白、脂肪、总糖、水分含量测定

蛋白质测定：按照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；脂肪测定：按照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中索氏提取法；总糖测定：按照GB/T 9695.31—2008《肉制品 总糖含量测定》中苯酚硫酸法；水分含量测定：按照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中直接干燥法。

1.3.4 乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）含量测定

1.3.4.1 样品前处理

取0.2 g样品加入5 mL体积分数30%甲醇溶液（磷酸盐缓冲液配制），振荡1 h后离心15 min，取上清液加入10 mg/mL邻苯二胺溶液，60 ℃暗条件下衍生1 h，用甲醇和超纯水依次活化Poly-Sery HLB-Pro固相萃取柱，待测液过柱后用超纯水除杂，用体积分数80%甲醇溶液洗脱，过0.22 μm聚醚砜滤膜待测。

1.3.4.2 标准溶液配制及标准曲线绘制

配制0、0.05、0.10、0.15、0.20 μg/mL GO、MGO标准溶液，加入10 mg/mL邻苯二胺溶液，60 ℃暗条件下衍生1 h，用甲醇和超纯水依次活化Poly-Sery HLB-Pro固相萃取柱，待测液过柱后用超纯水除杂，用体积分数80%甲醇溶液洗脱，过0.22 μm PES滤膜待测。

1.3.4.3 色谱条件

色谱柱：Symmetry C色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱温25 ℃；进样量10 μL；流速0.3 mL/min；流动相：体积分数0.2%甲酸溶液（A 相）和甲醇（B相），梯度洗脱程序：0～2.5 min，70%～40% A、30%～6 0% B；2.5～5.0 min，4 0%～3 0% A、60%～7 0% B；5.0～7.0 min，30%～70% A、70%～30% B；7.0～10.0 min，70% A、30% B。

1.3.4.4 MS条件

质谱条件见1.3.2.4节。GO、MGO的定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2。

表2 二羰基化合物多重反应监测采集参数Table 2 MRM mass spectrometric acquisition parameters for determination of α-dicarbonyl compounds

1.4 数据统计分析

采用Excel 2016软件进行数据处理，采用GraphPad Prism 8.2.1软件作图，采用Rv3.5.0及RStudio v1.1.453软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 AGEs检测方法建立

UPLC-MS/MS因其具有灵敏度高和定量准确等特点被用于AGEs的检测。Hull等使用UPLC-MS/MS建立食品中CML含量的检测方法；Scheijen等使用UPLC-MS/MS建立同时检测CML、CEL以及MG-H1含量的方法。然而，现有方法存在离子对试剂使用、耗时长等问题。本研究比较3 种色谱柱对AGEs的分离效果，发现ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）对CML、CEL、MG-H1具有良好的保留及分离效果，进一步发现乙腈-水溶液（水相中含0.25 mol/L乙酸铵和1%甲酸）对3 种AGEs分离效果最佳，该条件下CML、CEL、MG-H1保留时间分别为8.30、7.96、6.53 min（图1）。在10～200 ng/mL范围内，CML、CEL、MG-H1 标准曲线线性良好（=0.999），检出限低至2 ng/mL，定量限小于10 ng/mL（表3），精密度为1.35%～3.10%，加标回收率为80.13%～122.90%（表4）。因此，优化后建立的分析方法符合AGEs分析要求。

图1 CML、CEL和MG-H1的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of Nε-carboxymethyllysine,Nε-carboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

表3 CML、CEL和MG-H1的线性关系、检出限和定量限Table 3 Calibration curves,limits of detection and limits of quantification of Nε-carboxymethyllysine,Nε-carboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

表4 CML、CEL和MG-H1的精密度和回收率Table 4 Precision and recoveries for Nε-carboxymethyllysine,Nεcarboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

2.2 市售鱼加工食品中AGEs含量

应用所建立的UPLC-MS/MS检测方法分析65 种市售鱼加工食品的AGEs含量（以每100 g蛋白计），结果见图2。鱼加工食品的MG-H1含量为10.01～145.11 mg/100 g，CEL 含量为2.41～84.83 mg/100 g，CML 含量为1.93～35.31 mg/100 g。所有鱼加工食品中MG-H1含量均高于CML和CEL含量，其中茄汁沙丁鱼罐头的MG-H1含量约为其CML含量的20 倍，烤狮子鱼片的MG-H1含量为其CEL含量的11 倍。Scheijen等分析荷兰当地肉制品、乳制品、鱼制品、水果、蔬菜等190 种食品中的AGEs含量时也发现MG-H1含量大于CML和CEL含量的趋势。另外，罐头类鱼加工食品中3 种AGEs含量均呈较高水平，CML、CEL、MG-H1平均含量分别为13.20、34.26、62.73 mg/100 g，且含量分布范围较大，推测罐头制品的较高AGEs含量与其采用相对剧烈的杀菌方式有关。干制类鱼加工食品中AGEs含量普遍较低，其CML、CEL、MG-H1平均含量分别为6.45、6.07、19.48 mg/100 g。

图2 鱼加工食品的CML（A）、CEL（B）和MO-H1（C）含量分布箱形图Fig.2 Box plots of contents of Nε-carboxymethyllysine (A),Nεcarboxyethyllysine (B) and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine (C) in fish products

2.3 市售鱼加工食品组分及二羰基化合物含量

鱼加工食品的蛋白、脂肪、总糖、水分等组分含量受原料、辅料添加及加工过程的影响。65 种市售鱼加工食品的蛋白、脂肪、总糖、水分含量，如图3所示。4 类鱼加工食品的蛋白质量分数为22.68%～83.10%、脂肪质量分数为0.68%～50.59%、总糖质量分数为0.37%～43.13%（均以干质量计），水分质量分数为11.30%～82.70%（以湿质量计）。油炸类鱼加工食品蛋白含量相对较少与油炸会增加鱼加工食品的脂肪含量相关，烘烤类及油炸类鱼加工食品在加工过程中通常需要添加糖类以促进鱼加工食品的颜色及风味物质形成，因此其具有较高的总糖含量。与其他3 类鱼加工食品相比，罐头类鱼加工食品加工方式及辅料添加较为复杂，导致其脂肪、水分含量范围较大（脂肪质量分数2.54%～50.59%，水分质量分数11.30%～82.70%）。

图3 鱼加工食品的蛋白（A）、脂肪（B）、总糖（C）和水分（D）含量分布箱形图Fig.3 Box plots of contents of proteins (A),lipids (B),total sugars (C) and moisture (D) in fish products

GO、MGO等二羰基化合物是形成AGEs重要前体物质。65 种鱼加工食品的GO、MGO含量（以每千克蛋白计）如图4所示。GO含量为0.02～22.56 mg/kg，红杉鱼干、红娘鱼干、油炸鳗鱼丝、香辣银鱼、蒲烧秋刀鱼具有较高GO含量（大于10 mg/kg）；MGO含量为0.02～12.19 mg/kg，茄汁沙丁鱼与红烧金枪鱼具有较高MGO含量（大于10 mg/kg）。4 类鱼加工食品中，油炸类鱼加工食品GO平均含量最高（7.43 mg/kg），油炸类、罐头类鱼加工食品MGO平均含量较高，烘烤类鱼加工食品GO、MGO平均含量均最低。鱼加工食品在加工过程中，其自身成分通过糖降解等途径产生GO、MGO，同时调味品的添加也会引入GO、MGO。此外，罐头类鱼加工食品的GO、MGO含量还与杀菌工艺有关，Zhu Zongshuai等发现鸡肉经杀菌处理后GO含量增加，MGO含量降低。油炸类鱼加工食品中GO含量与烘烤类、罐头类鱼加工食品中GO含量存在显著差异（＜0.05）。

图4 鱼加工食品的GO（A）和MGO（B）含量分布箱形图Fig.4 Box plots of contents of glyoxal (A) and methylglyoxal (B) in fish products

2.4 PCA及相关性分析

如图5A所示，PCA发现，罐头类鱼加工食品中AGEs呈较高水平。Scheijen等应用UPLC-MS/MS分析190 种食品中CML、CEL、MG-H1水平发现罐头食品含有较高的AGEs。如图5B所示，鱼加工食品中3 种AGEs含量与脂肪含量呈显著正相关，这可能与鱼加工食品中脂肪氧化产生丰富的AGEs前体物质-二羰基化合物有关。CML与CEL（=0.69，＜0.001）、MG-H1含量（=0.54，＜0.001）呈显著正相关，CEL与MG-H1含量呈显著正相关（=0.81，＜0.001）；Michael、Sun Xiaohua等认为，3 种AGEs形成可能存在相同途径。CML、CEL、MG-H1含量与蛋白含量呈负相关，CML、CEL与总糖含量不相关，CML、CEL、MG-H1含量与GO、MGO等二羰基化合物含量不相关。刘慧琳等发现，牛血清蛋白-葡萄糖模拟体系中CML含量与蛋白、葡萄糖浓度之间均呈正相关，这可能是由于模拟体系的糖含量远高于食品体系，因此模拟体系中AGEs生成量随蛋白含量的增加而增加，食品体系糖含量的不确定性导致其中AGEs含量与蛋白含量之间呈明显的相关性，这需要进一步深入研究。

图5 鱼加工食品中所有指标的PCA（A）及相关性分析（B）Fig.5 PCA plot (A) and correlation heat map (B) of all tested indicators in fish products evaluated together

为比较各指标在不同种类鱼加工食品中的相关性，分别对烘烤类、油炸类、罐头类、干制类等4 类鱼加工食品的各项指标进行PCA（图6）发现，烘烤类鱼加工食品中CML-含量与脂肪含量呈正相关，MG-H1含量与MGO含量呈正相关。干制类鱼加工食品中MG-H1含量与MGO含量同样呈正相关，这是由于MGO为MG-H1前体物质。油炸类鱼加工食品中GO含量与总糖含量呈正相关，CML、CEL含量与蛋白含量呈正相关。干制类鱼加工食品中CML、CEL含量与蛋白含量也呈正相关，这可能是由于蛋白含量越高，可被糖基化修饰的赖氨酸等残基也相应增多，导致其产生较高的AGEs含量。罐头类、干制类鱼加工食品中CML、CEL含量与水分含量呈显著负相关，水分通过减少油脂与蛋白的接触影响美拉德反应进程，导致AGEs含量随水分含量的降低而上升。

图6 鱼加工食品中所有指标的PCAFig.6 PCA plots of all tested indicators in fish processing foods evaluated separately

3 结论

建立检测鱼加工食品中CML、CEL和MG-H1三种AGEs的UPLC-MS/MS方法；使用该方法分析65 种市售鱼加工食品的AGEs含量，发现鱼加工食品中MG-H1含量远高于CEL和CML；罐头类鱼加工食品中AGEs含量呈较高水平，而干制品中3 种AGEs的含量相对较低。鱼加工食品中3 种AGEs含量之间呈显著正相关；其AGEs含量与脂肪含量呈显著正相关，与蛋白含量呈显著负相关；烘烤类、干制类鱼加工食品中MG-H1含量与MGO含量呈正相关。本研究为探究鱼加工食品AGEs含量检测与限量标准的建立提供理论基础，对提升鱼加工食品安全水平具有重要意义。