基于ICP-MS的滩羊骨骼矿质元素溯源指纹图谱

王雪蓉，罗瑞明，李亚蕾，马梦斌

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

盐池滩羊肉质细嫩鲜美，不腥不膻，独具特色。近年来，滩羊被其他地方引进，但未能保持其原有品质特性，冒用、滥用品牌现象阻碍滩羊产业的稳定健康发展及地方特色产业保护[1-2]。因此，对标识盐池滩羊的副产品羊骨进行原产地溯源鉴定，建立一种快速高效的肉骨鉴别技术，完善滩羊品种保护体系，是当前亟需解决的问题。

原产地是影响骨产品商业价值的重要因素之一，比较常见的溯源方法有信息编码技术[3]、气相色谱法[4]、近红外光谱法[5]、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法[6-8]、能量散射X射线荧光光谱方法[9]等。骨骼作为体内矿质元素主要的储存部位，可以通过测定骨矿质元素含量进行区域鉴别。ICP-MS对矿质元素检出限低、选择性好，被广泛使用[10]。张欣昕[11]、骆仁军[12]等用矿质元素含量结合稳定同位素比值法分别对马铃薯、中华绒螯蟹进行产地鉴别，判别正确率均高于90.00%；Qi Jing等[13]利用机器学习辅助矿质元素分析区分中国不同产地的猪肉，总体准确率达95.71%；Zhang Hongru等[14]研究证明多元素分析结合线性判别模型是保证牦牛骨样品信息可靠性的有效方法。此外，矿质元素也被广泛应用于中国海参[15]、绿茶[16]、番茄[17]、葡萄酒[18]、牛羊肌肉组织[19-20]等产品的原产地溯源方面。这些研究充分说明基于矿质元素的原产地鉴别技术对同一物种不同产区的鉴别相对较快、准确性较高，具有很大的原产地区分潜力[21-22]。滩羊骨骼作为滩羊资源的一种副产品，国内外研究相对较少，可通过建立滩羊骨骼矿质元素溯源指纹图谱对其进行区域鉴别与保护。

本研究在已建立的滩羊肉原产地鉴别模型基础上，利用ICP-MS测定滩羊骨骼中25 种（Ag、Ba、Be、Ca、Cd、Cu、Co、Cr、Cs、K、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Te、V、Zn）矿质元素含量，通过方差分析、主成分分析（principal components analysis，PCA）、聚类分析等多元统计方法，建立滩羊骨骼矿质元素溯源指纹图谱，采用Fisher判别验证模型有效性，为滩羊骨骼的原产地鉴别和检测冒充、掺假滩羊骨产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集宁夏盐池县（麻黄山乡、高沙窝镇、冯记沟乡）、内蒙古自治区鄂托克前旗、陕西省定边县和甘肃省环县4 地7 月龄滩羊头骨、脊骨、四肢骨、肋骨样品，共计240 个样本，具体信息见表1。

表1 样品采集信息Table 1 Information of sheep bone samples

氢氟酸（MOS级） 上海旭恒商贸有限公司；高氯酸（MOS级） 南京化学试剂有限公司；Ca、Fe、Ni、Mn、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、Rb、Sn、P、Na、K、Mg、V、Cr、Co、Cs、Sb、Ba、Be、Cd、Te、Ag（1 000.00 μg/mL）元素标准溶液 北京仪化通标科技有限公司；Dura series超纯水处理系统（＞18.20 MΩ·cm） 上海和泰仪器有限公司；浓硝酸（65.00%）、浓盐酸（37.00%） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA-1004冷冻干燥机 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；冷冻球磨仪 德国Restsch公司；WX-8000微波消解仪 上海新仪微波化学科技有限公司；iCAPQ ICPMS仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将采集的骨骼样品剔除表面肉、肌腱和其他杂质，分别称取100.00 g，冷冻干燥48 h，粉碎研磨成粉末状，过200 目筛，备用。

1.3.2 样品消解

称取粉末状样品0.15 g至聚四氟乙烯消解罐中，加入2.00 mL双氧水、6.00 mL浓硝酸预消解20 min，然后放入微波消解仪中消解。消解程序：0～10 min，由0 ℃以18 ℃/min速率升高到180 ℃，保持5 min；在10 min内以6 ℃/min速率上升到240 ℃，保持25 min；最后，通风赶酸10 min，得到消解溶液。取消解液1.00 mL定容至50 mL，开始测样，同时做空白实验。

1.3.3 元素含量测定

使用ICP-MS仪测定滩羊骨骼样品中Ag、Ba、Be、Ca、Cd、Cu、Co、Cr、Cs、K、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Te、V、Zn 25 种矿质元素含量，结果以每千克样品干质量计。氩用于等离子体产生，添加内部标准（In、Ge、Sc元素）以补偿任何酸效应和仪器漂移。具体参数如下：扫描速率5 000 u/s；射频发生器功率1 550 W；分辨率0.30～3.00 u；质量范围1～285 u；雾化气流量1.12 L/min；载气流量0.98 L/min；样品提升速率1.20 L/min；冷却气流量14.00 L/min；驻留时间50.00 ms；离子透镜电压8.25 V；每质量数采集数据点50.00 ms；积分时间500.00 ms。样品中测定元素的含量按下式计算：

式中：x为试样中待测元素含量/（mg/kg）；ρ1为试样溶液中被测元素质量浓度/（mg/L）；ρ0为试样空白液中被测元素质量浓度/（mg/L）；V为试样消化液定容体积/mL；f为稀释倍数；m为试样称取质量/g。

1.4 数据处理

采用Office 2019、SPSS 23.0软件对矿质元素含量数据进行处理并作方差分析、PCA、K-均值聚类等多元统计分析。

2 结果与分析

2.1 矿质元素含量测定结果的准确性分析

对所有样本中25 种矿质元素含量进行检测，各元素回归方程、相关系数、相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）和检出限（limit of detection，LOD）见表2。

表2 各元素线性回归方程、相关系数、RSD和LODTable 2 Linear regression equations,correlation coefficients,RSDs,and LODs for various metal elements

选择拟合性较好的质量浓度范围绘制标准曲线，如表2所示，P、Se、Sn、Te 4 种矿质元素线性方程相关系数大于0.990 0，其余20 种矿质元素线性方程相关系数均大于0.999 0，RSD均小于7.00%。测定时用空白样品对仪器进样8 次，计算得出各元素LOD在0.001 3～3.306 0 μg/L范围内，说明该方法可用于检测滩羊骨骼矿质元素含量。

2.2 不同产地滩羊骨骼矿质元素分析

如表3所示，滩羊骨骼样品中Ba、Ca、Cd、Cu、Cr、Cs、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Sn、Se、Sr、Te、V、Zn 21 种矿质元素在4 个地区间存在显著差异（P＜0.05），Be、Co、K元素在4 个地区间差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同地区间滩羊骨骼中矿物元素含量Table 3 Contents of mineral elements in Tan sheep bones from four county-level regions

内蒙古鄂托克前旗样品中Ba、Cr、Na、Ni、Sr、Te、V含量在4 个地区间最高，Cd、Mn、P含量最低；甘肃环县样品中Cd、Mg含量在4 个地区间最高，Fe、Se 2 种元素含量最低；宁夏盐池县样品中Ca、Cu、Fe、K、Mn、P、Rb和Se 8 种矿质元素含量相对其他3 个地区最高，Ba、Ni、Te 3 种矿质元素含量显著低于其他3 个地区，高含量矿质元素相对较多；陕西定边县样品中Cs、Ni、Zn含量在4 个地区间最高，Sr、V 2 种元素含量最低。由此可见，不同产地滩羊骨骼元素组成分布特征各异，且相同矿质元素在不同产地滩羊骨骼中含量也差异显著。在此基础上，对宁夏盐池滩羊骨骼中矿质元素进一步分析，筛选显著性差异矿质元素，对其建立特有骨骼矿质元素产地溯源指纹图谱。

2.3 宁夏盐池县滩羊骨骼中矿质元素含量差异分析

对宁夏盐池县冯记沟乡、高沙窝镇、麻黄山乡滩羊骨骼中25 种矿质元素含量作方差分析，如表4所示，P、Na、V、Mg、Ca、Cr、Be、Mn、Zn、Se、Sr、Cd、Cs、Ba、Rb、Te 16 种矿质元素含量在宁夏盐池县3 个地区间存在显著差异（P＜0.05）。

表4 宁夏盐池县冯记沟乡、高沙窝镇、麻黄山乡滩羊骨骼中矿物元素含量Table 4 Contents of differential mineral elements among Tan sheep bones from Fengjigou,Gaoshawo and Mahuangshan in Yanchi,Ningxia

生物体中矿质元素含量特征与地区密切相关[23]。冯记沟乡滩羊骨骼中Ca、Cs、Mn、Rb、Se含量最高，其中仅Se含量与高沙窝镇差异不显著，Ba和Sr 2 种矿质元素含量显著低于其他两地；高沙窝镇滩羊骨骼中Ba、Be、Cd、P、Zn 5 种矿质元素含量高于麻黄山乡和冯记沟乡，其中Ba、Be和Zn含量显著高于麻黄山乡和冯记沟乡，而Rb、V含量显著低于其他两地；麻黄山乡滩羊骨骼中Cr、Na、Mg、Sr、Te、V含量高于其他两地，其中Cr、Mg和Sr含量显著高于冯记沟乡和高沙窝镇，Cs、Cd、Se含量显著低于冯记沟乡和高沙窝镇。可见，滩羊骨骼中矿质元素分布在小范围相似地区间也存在差异，若将此特征作为产地鉴别标识还存在不足，需将盐池县滩羊饲养代表性地区骨骼中具有显著差异的矿质元素进一步作多元统计分析。

2.4 宁夏盐池县滩羊骨骼中矿质元素的PCA

PCA通过降维思想研究实验各项指标的内在关系，在保留80%以上原有信息基础上，将多项指标减少为几个相互独立的综合指标[24]。相比其他统计学分析方法，PCA确定的权数是基于大量数据分析得到的指标间内在结构关系，不受主观因素影响，降维后得到的PC间彼此独立，避免信息交叉，使分析结果更加客观、可靠[25-26]。

对宁夏盐池县冯记沟乡、高沙窝镇、麻黄山乡滩羊骨骼中16 种含量差异显著的矿质元素进一步作PCA。由图1可知，冯记沟乡、高沙窝镇、麻黄山乡3 地滩羊骨骼矿质元素中具有显著差异的元素前4 个PC累计方差贡献率分别达到85.90%、81.20%、85.50%，基本保留了原元素的变化信息。结合图2可以非常直观地看出，冯记沟乡PC1主要由P、Na、Mg、Ca、Mn、Zn等构成，PC2由Rb、Cd、Se、Ba 4 种元素构成；PC3由Cs、Te构成；高沙窝镇PC1主要由P、Na、Ca、Mn、Zn、Te等元素构成，PC2主要由Cs、V、Cd 3 种元素构成，PC3由Rb构成；麻黄山乡PC1主要由P、Na、Mg、Ca、Zn、Cd等构成，PC2由Cs、Ba、Rb 3 种元素构成。PCA可以直观地表现滩羊骨骼中16 种矿质元素分布特征，找到不同地区间差异显著的特征元素，为产地指纹图谱构建提供理论依据。

图1 冯记沟乡（a）、高沙窝镇（b）、麻黄山乡（c）滩羊骨骼中矿质元素PC碎石图Fig.1 PCA scree plot of mineral elements in Tan sheep bones from Fengjigou (a),Gaoshawo (b) and Mahuangshan (c)

图2 冯记沟乡（a）、高沙窝镇（b）、麻黄山乡（c）滩羊骨骼中矿质元素PC载荷网络图Fig.2 PCA loading network plot of mineral elements in Tan sheep bones from Fengjigou (a),Gaoshawo (b) and Mahuangshan (c)

2.5 宁夏盐池县滩羊骨骼中矿物元素含量聚类分析

聚类即根据样品间相似程度进行简化合并分组，相似性最大的元素优先聚合在一起，最终按照类别的综合性质将多个样品聚合，使结果具有最大的组内相似性和最小的组间相似性[27-28]。采用K-均值聚类对盐池滩羊骨骼中矿质元素所取得的主要成分贡献值进行聚类分析，由表5可知，冯记沟乡滩羊骨骼中16 种矿质元素指标被聚为3 类：第1类包括Ca、Mn、Na、P、Se、Zn；第2类包括Be、Cs、Mg、Rb、Te，第3类包括Ba、Cd、Cr、Sr、V，结合2.4节PCA结果，Ca、Mg、Mn、Na、P、Rb、Se、Zn这8 种元素可以作为冯记沟乡滩羊骨骼的矿质元素溯源指标。高沙窝镇滩羊骨骼中16 种矿质元素指标被聚为3 类：第1类包括Be、Ca、Mn、Na、P、V、Te、Zn；第2类包括Ba、Cd、Cs、Mg、Se，第3类包括Cr、Rb、Sr，结合2.4节PCA结果，Ca、Cd、Cs、Mn、Na、P、Te、Zn这8 种元素可以作为高沙窝镇滩羊骨骼的矿质元素溯源指标。麻黄山乡滩羊骨骼中16 种矿质元素指标被聚为3 类：第1类包括Ca、Cd、Mg、Mn、Na、P、Se、Zn；第2类包括Be、Cr、Cs、Rb、Sr、Te，第3类包括Ba、V，结合2.4节PCA结果，Ca、Cd、Cs、Mg、Na、P、Rb、Zn这8 种元素可作为麻黄山乡滩羊骨骼的矿质元素溯源指标。综上所述，Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn这10 种矿质元素可以作为盐池县滩羊骨骼中矿质元素的溯源指标。

表5 冯记沟乡、高沙窝镇、麻黄山乡滩羊骨骼中矿质元素含量聚类分析结果Table 5 Cluster analysis of mineral elements in Tan sheep bones from three towns in Yanchi county

2.6 宁夏盐池滩羊骨骼中矿物质元素的判别分析

选取采集的陕西定边县、内蒙古鄂托克前旗、宁夏盐池县和甘肃环县4 地滩羊骨骼样品，测定其矿质元素含量，检验已筛选出的溯源指标对随机滩羊骨骼样品产地鉴别效果。利用2.5节中盐池滩羊骨骼溯源指标中的10 种元素（Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn）建立判别模型。在0.05显著性水平上，将Ca、Cs、Mg、Mn、Se、P、Te 7 种对地域判别显著的元素引入到Fisher判别模型中。具体判别模型如下：

y1＝71.07x1＋49.88x2－0.24x3－412.01x4＋11.05x5＋163.16x6－8.63x7－1 217.90

y2＝194.25x1－18.70x2＋0.14x3＋208.19x4－6.53x5＋107.54x6＋5.27x7－423.76

y3＝64.44x1－23.74x2＋0.10x3＋216.45x4＋5.59x5＋66.30x6＋4.17x7＋263.07

y4＝53.98x1＋14.52x2＋0.06x3＋321.12x4＋3.99x5－27.75x6＋1.98x7－122.76

式中：y1、y2、y3、y4分别为宁夏盐池县、内蒙古鄂托克前旗、甘肃环县、陕西定边县4 个地区模型计算值；x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分别为Ca、Cs、Mg、Mn、Se、P、Te含量/（mg/kg）。

利用此判别模型对样品进行归类，将矿质元素含量测定值代入上述模型中计算，比较所得y值，将样品归为y值最大的一类，并结合回代检验和交叉检验对模型有效性进行验证。由表6可知，滩羊骨骼样品来源整体判别效果较好。4 个地区的回代检验和交叉检验的整体正确率均在85.00%以上，其中对宁夏盐池县的判别效果最好，回代检验和交叉检验正确率均达90.00%。陕西定边县骨骼样品被错判为内蒙古鄂托克前旗和甘肃环县，致使检验正确率稍低，同时，其他地域被错判的样品多被错判为陕西定边县样品，可能是其中差异不显著元素占比较大，区分性不高。此外，宁夏盐池县和甘肃环县样品也存在相互错判。

表6 4 个地区滩羊骨骼样品的LDA结果Table 6 LDA results of Tan sheep bone samples from four county-level regions

对样品前2 个判别函数得分作散点图，如图3所示，每个地区样品均被较好的归类，各具空间分布特征，这与PCA、聚类分析结果基本一致，Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn可作为盐池滩羊骨骼矿质元素指纹图谱，表明筛选出用作滩羊骨骼产地鉴别的10 种矿质元素是有效的，并且利用该10 种元素指标建立的判别模型亦有效。

图3 滩羊骨骼样品的前两个判别函数得分散点图Fig.3 Scatter plot of Tan sheep bone samples on the first two discriminant functions

本研究中筛选的矿质元素溯源指纹图谱，整体正确判别率约为85.00%，与Sun Shumin[19]、Zhang Hongru[14]等的研究结果相比，判别正确率较低，可能是土壤、气候、饲喂草料等诸多因素对矿质元素含量有影响，进而影响判别结果[29-30]。后期拟添加气候、土壤等环境因素，采集大样本量，结合具有地域代表性的稳定同位素、化学计量方法进行研究，继续完善指纹图谱信息，提高判别正确率，从而有效区分不同产地滩羊骨骼，为羊骨的产地鉴别提供理论依据。

3 结论

通过对宁夏盐池县、内蒙古鄂托克前旗、甘肃环县和陕西定边县4 个地区滩羊骨骼中25 种（Ag、Ba、Be、Ca、Cd、Cu、Co、Cr、Cs、K、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Te、V、Zn）矿质元素含量进行测定，运用PCA等多元统计分析方法得出以下结论：1）滩羊骨骼样品中Ba、Ca、Cd、Cu、Cr、Cs、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Se、Sr、Te、V、Zn 19 种矿质元素在4 个地区间存在显著差异，内蒙古鄂托克前旗样品中Ba、Cr、Na、Ni、Sr、Te、V含量在4 个地区间最高，甘肃环县样品中Cd、Mg含量最高，宁夏盐池县样品中Ca、Cu、Fe、K、Mn、P、Rb、Se含量最高，陕西定边县样品中Cs、Ni、Zn含量最高，不同产地间滩羊骨骼的组成元素各具分布特征，同时相同矿质元素在不同原产地间也差异显著。2）筛选出盐池滩羊骨骼矿质元素指纹溯源图谱为Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn，通过Fisher判别，Ca、Cs、Mg、Mn、Se、P、Te 7 种矿质元素被引入判别模型中，回代检验的整体正确判别率为87.50%，交叉检验的整体正确判别率为86.87%，建立的矿质元素溯源指纹图谱可用于区分不同地区滩羊骨骼。