三氧化二砷对T急淋白血病及DNA转甲基酶1的影响

苏嘉茵，吴忠道，罗学群

（1.中山大学附属第一医院儿科，广东广州 510080；2.中山大学中山医学院寄生虫学教研室//中山大学热带病防治研究教育部重点实验室，广东广州 510080）

急性淋巴细胞白血病是一种大量原始和幼稚的淋巴细胞在骨髓异常增生的血液癌症，是儿童最常见的恶性肿瘤。三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）用于急性早幼粒细胞白血病取得较好疗效，有文献提示ATO 在体外能诱导髓系、淋巴系和浆细胞性白血病细胞株凋亡，且有研究发现ATO 可改善耐药性急性淋巴细胞白血病（Acute lymphocytic leukemia，ALL）对化疗药物的敏感性［1］。但目前关于ATO 在急性T 淋巴细胞白血病（Acute Tlymphocytic leukemia，T-ALL）中的应用研究较少，其作用机制仍有待进一步探索。本研究主要选取人类T-ALL 细胞株，探索ATO 对T-ALL 细胞中DNMT1表达的影响及其抗白血病作用机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试 剂

本实验所用的三氧化二砷（ATO）是由医院采购部经广州市食品药品监督管理局审核后所购买。ATO溶于PBS制备为1 mmol/L的储备液；Z-DEVDFMK（caspase-3抑制剂）购自Selleck（#S7312），按产品说明书储存，使用浓度为25µmol/L。

1.2 实验分组与处理

体外培养T-ALL 细胞系（Jurkat、CCRF-CEM、Molt-4）至细胞状态良好，依据干预的ATO 浓度的不同，分为对照组、低浓度组、高浓度组，对照组用DMSO（3 mL/L）处理24 h，低浓度组和高浓度组分别予以3µmol/L、6µmol/L ATO 处理24 h 后进行后续实验；依据ATO 和Z-DEVD-FMK 干预的不同，分为ATO组和ATO+DEVD组，ATO组予以6µmol/L ATO 处理24 h，ATO+DEVD 组同时加入6 µmol/L ATO 和25µmol/L Z-DEVD-FMK（caspase-3特异性抑制剂）干预24 h后进行后续实验。

1.3 Annexin-V/PI流式细胞检测

T-ALL 细胞经过ATO 或Z-DEVD-FMK 按特定浓度处理后培养24 h，分别收集不同ATO浓度处理的细胞离心（400×g，10 min）。用Annexin-V/PI试剂盒（KeyGEN，#KGA108）按产品说明书检测并统计Annexin-V+PI+染色阳性的细胞比例。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

TRIzol 法提取T-ALL 细胞的总RNA，20 µL mRNA 逆转录体系中加入5×Prime Script RT Master Mix 4 µL 以及1 000 ng 总RNA 模板进行逆转录，获得相应的cDNA，以GAPDH为内参检测相关基因mRNA 表达水平。利用BioRad CFX Quantitative PCR System 进行实时荧光定量PCR 并分析所得实验结果。计算2-ΔΔCt相应值，比较不同实验分组间DNMT1基因的表达水平。相应的引物序列列于表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.5 Western blot蛋白印迹检测

用RIPA 裂解法提取细胞总蛋白，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，#P0012S）按照产品说明书测定蛋白浓度并进行热变性。将制成的蛋白进行电泳（SDS-PAGE），根据蛋白大小选择合适的转膜条件将蛋白转移到硝酸纤维素（NC）膜上，蛋白条带加入一抗4 ℃过夜孵育，二抗孵育2 h。用增强型化学发光法（ECL）检测确定目的蛋白的表达强弱，GAPDH或β-actin作为内参。

1.6 DNMT1过表达质粒转染

将T-ALL 细胞接种于12 孔板，当细胞密度70%～90%时，进行细胞pECMV-DNMT1过表达质粒转染，对照组转染空载质粒。具体实验操作如下：分别将1.875 µL Lipofectamine™3000 试剂用62.5 µL Opti-MEM 培养基稀释成混合液A，2.5 µg质粒用62.5 µL Opti-MEM 培养基稀释，与2.5 µL P3000™试剂混合成混合液B。再将混合液B 加入混合液A 中，室温孵育15 min 后，加入细胞培养皿中。细胞在37 ℃和5 % CO2的培养箱中继续培养48 h后，分别检测DNMT1的表达水平和用6µmol/L ATO 处理24 h 后检测细胞死亡率。过表达质粒序列如下：pECMV-DNMT1：5’-AGGCGGCTCAAAGATTTGGAA-3’。

1.7 统计学分析

数据的统计分析用GraphPad Prism 8进行。两组数据的比较采用成组t检验进行分析。多组之间的比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。图表和误差条代表独立生物实验的平均值±标准差。

2 结果

2.1 不同浓度ATO干预对T-ALL细胞存活的影响

ATO 以不同浓度（0、3、6 µmol/L）干预24 h 后进行流式检测。对三个不同浓度组干预后的细胞PI 阳性率进行检测比较，经单因素方差分析，ATO处理后Jurkat 细胞的三组间差异有统计学意义（F=78.53，P＜0.000 1），采用Bonferroni法进一步作两两比较发现，对照组与低浓度组（3µmol/L）比较差异无统计学意义（P=0.321 3），而与高浓度组（6µmol/L）比较差异有统计学意义（P＜0.000 1）；ATO 处理后CCRF-CEM 细胞的三组间差异有统计学意义（F=136.9，P＜0.000 1），作两两比较，发现对照组与低浓度组比较差异有统计学意义（P=0.000 2），与高浓度组比较差异有统计学意义（P＜0.000 1）；ATO处理后MOLT-4 细胞的三组间差异有统计学意义（F=40.26，P=0.000 3），作两两比较，发现对照组与低浓度组比较差异无统计学意义（P=0.133 4），与高浓度组比较差异有统计学意义（P=0.000 3）。随着ATO 干预浓度的增加，T-ALL 细胞株Jurkat、CCRF-CEM、Molt-4 的PI 阳性率增加，表明ATO 对T-ALL细胞具有杀伤作用，呈浓度依赖性（图1）。

图1 Annexin-V/PI流式细胞检测急性T淋巴细胞白血病细胞株的细胞死亡率Fig.1 Annexin-V/PI flow cytometry showed the cellular mortality of acute T-lymphocytic leukemia cell lines.

2.2 不同浓度ATO 干预对T-ALL 细胞DNMT1 和cleaved-caspase-3表达的影响

ATO 以三个不同浓度干预后对DNMT1和cleaved-caspase-3的表达水平进行检测比较。经方差分析，用ATO 处理后三组间DNMT1的mRNA 表达水平差异有统计学意义，（F=64.45，P＜0.000 1；图2A），采用Bonferroni 法进一步作两两比较，发现Jurkat细胞低浓度组（3µmol/L）的DNMT1的mRNA表达水平与对照组相比显著降低（P=0.002），高浓度组（6 µmol/L）与对照组相比显著降低（P=0.000 3）；CCRF-CEM 细胞低浓度组（3 µmol/L）与对照组相比降低，但差异不具有统计学意义（P=0.050 9），高浓度组（6 µmol/L）与对照组相比显著降低（P＜0.000 1）；MOLT-4 细胞低浓度组与对照组相比显著降低（P=0.013 9），高浓度组（6µmol/L）与对照组相比显著降低（P＜0.000 1）；三组间DNMT1的蛋白表达水平差异有统计学意义（F=3.557，P=0.049 9；图2B），采用Bonferroni 法进一步作两两比较，发现Jurkat 细胞的对照组与低浓度组（3µmol/L）比较差异无统计学意义（P=0.171），与高浓度组（6 µmol/L）比较差异有统计学意义（P=0.0212）；CCRF-CEM 细胞的对照组与低浓度组比较差异无统计学意义（P=0.718 9），与高浓度组比较差异有统计学意义（P=0.017 6）；MOLT-4 细胞的对照组与低浓度组比较差异无统计学意义（P=0.264 3），与高浓度组比较差异有统计学意义（P=0.003 1）。经方差分析，用ATO 处理后三组间cleaved-caspase-3蛋白表达水平差异有统计学意义（F=4.758，P=0.021 9；图3C），采用Bonferroni 法进一步作两两比较，发现Jurkat 细胞的对照组与低浓度组（3 µmol/L）比较差异无统计学意义（P=0.294 0），高浓度组（6 µmol/L）与对照组相比显著升高（P=0.013 0）；CCRF-CEM 细胞的对照组与低浓度组比较差异无统计学意义（P=0.232 4），高浓度组（6 µmol/L）与对照组相比显著升高（P=0.038 3）；MOLT-4 细胞的对照组与低浓度组比较差异无统计学意义（P=0.286 5），高浓度组（6µmol/L）与对照组相比显著升高（P=0.010 2）。由图2 可见，随着ATO 干预浓度的增加，T-ALL 细胞株Jurkat、CCRF-CEM、Molt-4中DNMT1的mRNA及蛋白表达水平逐渐降低，cleaved-caspase-3的蛋白表达水平逐渐增加，表明ATO 可同时抑制T-ALL 细胞的DNMT1表达并激活cleaved-caspase-3的蛋白表达，呈浓度依赖性。

图2 急性T淋巴细胞白血病细胞中DNMT1和cleavedcaspase-3的表达水平Fig.2 The expression levels of DNMT1 and cleaved-caspase-3 in acute T-lymphocytic leukemia cells

图3 抑制caspase-3后ATO对急性T淋巴细胞白血病细胞DNMT1表达影响的改变Fig.3 Changes in the effect of ATO on DNMT1 expression in acute T-lymphocytic leukemia cells after inhibition of caspase-3

2.3 抑制caspase-3 后ATO 对T-ALL 细胞中DNMT1表达影响的变化

由图3A 可见，对ATO 组和ATO+DEVD 组的DNMT1基因表达水平进行检测比较，经t检验分析，Jurkat 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=3.773，P=0.008 9），CCRF-CEM 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=3.709，P=0.008），MOLT-4细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=5.55，P=0.000 4）；由图3B 可见，对ATO 组或ATO+DEVD 组的DNMT1蛋白表达水平进行检测比较，经t检验分析，Jurkat 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=28.76，P＜0.000 1），CCRF-CEM 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=15.71，P＜0.000 1），MOLT-4细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=12.29，P=0.000 3）；对ATO 组或ATO+DEVD 组的cleaved-caspase-3蛋白表达水平进行检测比较，经t检验分析，Jurkat 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=51.04，P＜0.000 1），CCRF-CEM 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=4.966，P=0.007 7），MOLT-4细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=5.069，P=0.007 1）。结果表明应用Z-DEVD-FMK（caspase-3的特异性抑制剂）可有效抑制cleaved-caspase-3的表达水平，cleaved-caspase-3是caspase-3的活化形式，表明Z-DEVD-FMK 可有效抑制caspase-3的活化水平，ATO+DEVD 组相对于ATO 组的DNMT1基因及蛋白表达水平均显著升高，说明抑制caspase-3的活化可解除ATO对DNMT1表达的抑制作用。

2.4 ATO 通 过 活 化caspase-3 抑 制DNMT1 表 达对T-ALL细胞死亡的影响

由图4A 可见，对ATO 组与ATO+DEVD 组的细胞PI 阳性率进行检测比较，经t检验分析，Jurkat 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=5.629，P=0.004 9），CCRF-CEM 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=5.749，P=0.004 5），MOLT-4 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=16.79，P＜0.000 1），说明应用Z-DEVD-FMK 抑制caspase-3可显著降低T-ALL 细胞的死亡率，表明ATO 通过活化caspase-3发挥对T-ALL 细胞的杀伤作用；转染pECMV-DNMT1过表达质粒的T-ALL 细胞与对照组相比DNMT1的表达水平显著上调（P＜0.05；图4B）；将DNMT1过表达组与对照组的T-ALL细胞分别用6 µmol/L ATO 处理后用Annexin-V/PI 流式细胞术检测PI 阳性的细胞死亡率，经t检验分析，Jurkat 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=7.64，P＜0.000 1），CCRF-CEM 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=17.72，P＜0.000 1），MOLT-4 细胞的两组间比较差异有统计学意义（t=13.26，P＜0.000 1），说明ATO处理后DNMT1过表达组与对照组相比细胞死亡率显著下降（P＜0.05；图4C，D），提示ATO通过抑制DNMT1表达诱导T-ALL细胞死亡。

图4 ATO抑制DNMT1表达对急性T淋巴细胞白血病细胞死亡的影响Fig.4 The effect of the inhibition of DNMT1 by ATO on the cell mortality in acute T-lymphocytic leukemia cells

3 讨论

3.1 主要研究发现

为探索ATO 对急性T 淋巴细胞白血病的去甲基化作用和抗肿瘤作用机制，本研究检测了ATO对T-ALL细胞中DNMT1表达的影响及其潜在作用机制。已有临床研究表明，ATO的临床血药浓度峰值为6～7 µmol/L，而后下降并维持在1～2 µmol/L内［2-3］，过往关于ATO 的体外研究多数将作用浓度设置在0～8µmol/L范围内［4-6］。本实验在0-6µmol/L 浓度范围内检测其药物作用，发现ATO 在体外通过激活caspase-3显著抑制DNMT1的表达从而诱导T-ALL细胞死亡，这种作用呈剂量依赖性。

3.2 意义与应用

急性淋巴细胞白血病是大量原始和幼稚的淋巴细胞在骨髓异常增生的血液癌症，是儿童最常见的恶性肿瘤，占所有小儿癌症病例的近四分之一［7］。根据免疫表型，ALL 病例可大致分为急性B细胞淋巴细胞白血病、急性T 细胞淋巴细胞白血病（T-ALL）及混合型白血病，其中T-ALL占初诊患者的10%～15%。T-ALL 是一种由未成熟T 细胞前体（T 淋巴细胞）引起的血液系统恶性肿瘤［8］。TALL 患者的预后较差，具有更高的复发风险［9］。TALL 的原始幼稚细胞对常规化疗药物更具抵抗力，耐药是导致预后差的重要危险因素［10-11］。探索TALL 的耐药机制，挖掘新型有效的临床药物是改善预后的重要途径。

肿瘤化疗过程中的耐药与基因组高甲基化水平密切相关，DNA 转甲基酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）是人体内最重要的转甲基酶，在白血病中呈高表达的状态［12-13］。近来有研究表明，耐药的T 细胞白血病-淋巴瘤细胞系中未呈现出非耐药细胞对化疗药物的细胞反应，包括DNMT1的消耗和DNA 低甲 基化的状态［12］，而DNA 去甲基化治疗的表观遗传改变可恢复对化疗耐药的人类恶性淋巴细胞对化疗药物的凋亡反应［14］。这些研究提示可以通过将细胞暴露于有DNA 去甲基化作用的化合物来逆转T-ALL 的耐药。但目前仍缺乏抑制T-ALL 中DNMT1表达的药物研究。目前已有关于ATO 对T-ALL 的药物作用研究较少，尚不清楚ATO 是否可以降低T-ALL 中的DNMT1表达，本研究为这一领域的研究作了补充。

ATO作为临床上已应用成熟的药物，其安全性和疗效都较可靠，本研究的新发现完善了国内外关于ATO 在T-ALL 中抗肿瘤作用机制的研究，有利于进一步探索ATO 去甲基化作用的具体机制，有利于为难治性耐药性T-ALL 的治疗提供新选择。然而，关于ATO 是否能通过抑制DNMT1逆转T-ALL 患者化疗耐药性还有待进一步探索。

3.3 结论与展望

综上所述，在一定浓度范围内，ATO 可通过激活caspase-3有效抑制T-ALL 细胞中的DNMT1表达从而诱导细胞死亡，为未来ATO 作为去甲基化药物应用于提高T-ALL 的临床治疗提供了一定的理论依据。