膳食菊苣酸对过敏性哮喘小鼠的体内调节作用

李 琴，申云琴，郭兴悦，徐艺璇，李灵杰，武音帆，杨 燕，陈彦球

（1.中山大学公共卫生学院（深圳），广东深圳 518000；2.广东省营养与健康重点实验室，广东广州 510080；3.广东省营养转化工程技术研究中心，广东广州 510080；4.中山大学公共卫生学院，广东广州 510080；5.同济大学附属上海市第四人民医院，临床营养科，上海 200434；6.广州市妇女儿童医疗中心耳鼻喉科，广东广州 510623）

哮喘是一种以气道的高反应性、阻塞、重塑为特征的炎症性疾病，全世界大约有3 亿人患有哮喘，且患病率逐年上升［1］。过敏性哮喘是哮喘中的主要类型，占60%～80%［2］。过敏性哮喘的发病机制复杂，尚未完全阐明，其中，T 细胞尤其是2 型辅助性T 细胞（Th2）分化失衡理论长期以来被认为是其主要发病机制［3］。并且，过敏性哮喘的一线治疗药物糖皮质激素也以Th2 为靶点发挥作用，但是此种药物存在很多副作用，且对难治型哮喘没有效果［4］。因此，寻找更为安全有效的治疗手段具有极大的实用价值。膳食营养因素与过敏性疾病等免疫相关疾病的发生发展密切相关［5］。例如，一项为期10 年的多中心人群横断面研究显示，更频繁地食用水果、蔬菜和鱼类与更低的哮喘患病率相关［6］。除了健康的膳食模式以外，多种膳食营养素如槲皮素等天然植物化学物也能有效缓解和治疗过敏性哮喘［7］。天然植物营养素菊苣酸（cichoric acid），是一种羟基肉桂酸，属于苯丙酸家族。菊苣酸存在于许多植物的根部，在菊苣、紫锥花和罗勒中含量尤其丰富。研究证明，菊苣酸具有多种有益的生物功效，如调节免疫功能、抗病毒、抗炎症、抗氧化等［8］，但菊苣酸对过敏性哮喘是否具有调节作用尚不清楚。因此，本研究通过膳食添加菊苣酸干预过敏性哮喘小鼠，旨在初步探索菊苣酸对过敏性气道炎症的体内治疗效应，为防治过敏性哮喘提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

菊苣酸（＞98%，阿拉丁），AIN 93G 饲料，卵清蛋白（Sigma），氢氧化铝（阿拉丁），DNA酶（Roche），流式细胞术抗体CD3e（PE-eFluor® 610）、CD4（APC-eFluor® 780）、CD8a（FITC）、IL-17A（PE）、IL-4（PE-Cy7）、IFNγ（APC），细胞刺激剂、破膜破核剂（eBioscience）。

1.2 实验动物与分组

5 周龄SPF 级 雌性BALB/c 小鼠，体质量19～21g，购自中山大学实验动物中心，饲养于中山大学公共卫生学院SPF 级动物房。随机将小鼠分为4组（n=4）：正常组（Control）、过敏性哮喘模型组（OVA）、膳食菊苣酸干预组（OVA+CA）和药物对照组（OVA+DEX）。实验前在动物房适应性饲养一周，实验期间小鼠自由摄食与饮水，垫料定期更换，定期监测小鼠摄食量与体质量。动物实验获得中山大学动物伦理委员会批准，许可证号：SYXK［粤］2017-0080。

1.3 实验动物干预与样本采集

1.3.1 过敏性哮喘小鼠模型 过敏性哮喘小鼠造模方法具体如下：在第0 天、第7 天和第14 天进行致敏，具体方法为使用200 µL OVA 溶液（含40 µg OVA，4 mg 氢氧化铝，溶于PBS），于小鼠左下腹腹腔注射；第21 天至第25 天进行激发，操作是采用5%的OVA 溶液雾化给药30 min，随后用40µg/µL的OVA 溶液滴鼻给药，每日1 次。正常对照组用PBS进行相同操作。

1.3.2 膳食菊苣酸干预 将菊苣酸粉末均匀混合于饲料中，制成菊苣酸含量为400 mg/kg 的饲料饲喂膳食菊苣酸干预组。其余组给予普通饲料。

1.3.3 样本采集和指标检测 末次激发后，记录10 min 内各组小鼠的挠鼻次数。24 h 内使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，心脏取血法获取小鼠全血用于检测血细胞，采集左肺固定于40 g/L 多聚甲醛中待病理学处理分析，采集右肺用于检测肺组织T 细胞亚群。

1.4 肺部病理染色与病理评分方法

取新鲜小鼠肺组织用40 g/L 多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红（HE）染色和过碘酸-雪夫（PAS）染色。在光学显微镜下观察H&E染色切片，放大400 倍，每个切片随机选取5 个气管，进行炎症评分，评分范围为0～5 分：“0”分为未见炎症浸润，“1”分为受影响气道范围＜20%，“2”分为20%～40%受影响气道范围，“3”定义为40%～60%，“4”定义为60%～80%和“5”定义为＞80%受影响气道范围。显微镜下放大400 倍观察PAS 染色切片，每个切片随机选取5 个气管，用Image J 软件分析气管中PAS阳性区域占整个气管的比例，从而分析肺部杯状细胞增生情况。

1.5 外周血细胞的测定

取小鼠的全血，使用配备五分类血细胞试剂盒（DREW SCIENTIFIC）的全自动动物血液分析仪（HEMAVET 950），检测血液中白细胞的数量以及各种白细胞亚类（包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）的百分比，根据嗜酸性粒细胞比例和淋巴细胞比例计算嗜酸性粒细胞/淋巴细胞比值（ELR）。

1.6 流式细胞术

取小鼠新鲜完整的肺组织，使用DNA 酶和胶原酶消化1 h。随后进行研磨，加入细胞刺激剂于CO2培养箱中培养5 h。培养后用buffer Ⅱ洗涤两遍，然后使用相应抗体和破膜破核剂按顺序进行表面染色（CD3、CD8、CD4）、破膜破核和胞内染色（IL-4、IL-17A、IFNγ）。洗涤后用200 µL buffer Ⅱ重悬，10%多聚甲醛固定，使用贝克曼分析型流式细胞仪（CytoFLEX S）上机检测。

1.7 统计学分析

研究数据使用IBM SPSS 23.0 软件进行分析，计量资料以mean ± SEM 的形式表示，使用Graph-Pad Prism 5 软件绘制统计图。各组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行比较，并采用LSD 法进行随后的两两比较；如数据不满足正态性和方差齐性则使用Kruskal Wallis 检验。双侧检验，P＜0.05 视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 膳食菊苣酸对小鼠体质量变化的影响

在进行OVA激发（Day 21）之前，各组小鼠的体质量呈逐渐增长的趋势（图1A）；在激发后，除正常组外，其他三组小鼠的体质量开始出现不同程度的减轻（图1A）。进一步比较各组小鼠在激发前后的体质量差值，发现膳食菊苣酸干预组的体质量下降情况较OVA 组小鼠相比明显缓解，差异具有统计学意义（P＜0.05；图1B）；药物对照组的体质量也呈现恢复趋势，相比于OVA 组小鼠，差异尚未达到统计学意义（P=0.072）。

图1 小鼠体质量变化情况Fig.1 The change of body weight in mice

2.2 膳食菊苣酸对小鼠鼻部症状的影响

激发后，OVA 组小鼠烦躁不安，频繁挠鼻，箭头所指之处鼻部胡须稀疏、短缺（图2A）。与正常组相比，OVA组小鼠挠鼻次数明显增多（P＜0.001），而膳食菊苣酸干预后，小鼠挠鼻次数明显减少（P＜0.05；图2B）。

图2 小鼠鼻外观与挠鼻频率Fig.2 Nasal appearance and rubbing frequencies of mice

2.3 膳食菊苣酸对小鼠外周血中炎症细胞的影响

相比正常组小鼠，OVA 组外周血中的总白细胞数量（P＜0.05；图3A）、嗜酸性粒细胞比例（P＜0.01；图3B）、嗜酸性粒细胞/淋巴细胞比值（P＜0.001；图3D）、嗜碱性粒细胞比例（P＜0.01；图3E）、单核细胞比例（P＜0.01；图3F）和中性粒细胞比例（P＜0.01；图3G）均升高，差异均有统计学意义。经膳食菊苣酸干预后，小鼠外周血中的总白细胞数量（P＜0.05；图3A）、嗜酸性粒细胞比例（P＜0.05；图3B）、嗜酸性粒细胞/淋巴细胞比值（P＜0.05；图3D）、嗜碱性粒细胞比例（P＜0.01；图3E）、单核细胞比例（P＜0.01；图3F）和中性粒细胞比例（P＜0.05；图3G）较OVA 组小鼠均下降，差异均有统计学意义。与正常组相比，OVA 组小鼠外周血淋巴细胞比例有所下降，差异尚无统计学意义（P＞0.05；图3D）。

图3 小鼠外周血炎症细胞Fig.3 Peripheral blood cells of mice

2.4 膳食菊苣酸对小鼠肺组织炎症细胞浸润和杯状细胞增生的影响

相比正常组小鼠，OVA 组小鼠肺组织出现炎症浸润（P＜0.001；图4B）和杯状细胞增生（P＜0.05；图4D），差异具有统计学意义。经膳食菊苣酸干预后，小鼠肺组织炎症浸润（P＜0.05；图4B）和杯状细胞增生情况（P＜0.05；图4D）有所缓解，差异具有统计学意义。

图4 小鼠肺组织炎症浸润与杯状细胞增生Fig.4 Pulmonary inflammation and goblet hyper-production in lung tissues of mice

2.5 膳食菊苣酸对小鼠肺组织中各类Th 细胞亚型的影响

相比正常组小鼠，OVA 组小鼠肺组织中Th2细胞比例（P＜0.001；图5D）和Th17 细胞比例（P＜0.01；图5E）明显上升，差异具有统计学意义。经膳食菊苣酸干预后，小鼠肺组织中Th2细胞比例（P＜0.001；图5D）和Th17 细胞比例（P＜0.001；图5E）相比于OVA 组明显下降，差异具有统计学意义。在各实验组中，Th1细胞比例没有差异（P＞0.05；图5F）。

图5 小鼠肺组织中Th细胞百分比Fig.5 The percentages of Th in the lung tissues of mice

2.6 膳食菊苣酸对小鼠肺组织中各类Tc 细胞亚型的影响

相比正常组小鼠，OVA 组小鼠肺组织中Tc2 细胞比例（P＜0.001；图6D）和Tc17 细胞比例（P＜0.05；图6E）显著上升，差异具有统计学意义。经膳食菊苣酸干预后，小鼠肺组织中Tc2 细胞比例（P＜0.001，图6D）和Tc17 细胞比例（P＜0.001；图6E）相比于模型组明显下降，差异具有统计学意义。在各实验组中，Tc1细胞比例没有差异（P＞0.05；图6F）。

图6 小鼠肺组织中Tc细胞百分比Fig.6 The percentages of Tc in the lung tissues of mice

3 讨论

本研究首次发现膳食菊苣酸干预能够有效改善小鼠过敏性哮喘，包括改善小鼠的体质量减轻现象、缓解鼻部瘙痒症状，有效降低外周血中炎症细胞的数量和比例，改善肺组织炎症细胞浸润和杯状细胞增生情况，下调肺部Th2、Th17、Tc2、Tc17 比例，提示膳食菊苣酸对过敏性哮喘小鼠的体内炎症具有抑制作用。

在受到过敏原刺激的人群中，Th2 细胞所产生的过度的免疫反应是导致过敏性哮喘的根本原因，靶向Th2 免疫反应的药物至今为止仍是过敏性哮喘的主要治疗手段，也是判断治疗方法是否有效的主要标准之一［9］。当机体受到过敏原刺激时，CD4+T 细胞趋向于分化成Th2、Th17 细胞，而分化为Th1细胞受到抑制，打破了正常机体环境中的Th1/Th2/Th17 平衡。Th2 细胞过度分化并分泌相关细胞因子如IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13，这些细胞因子进而促进B细胞增殖和免疫球蛋白E（IgE）生成，并且导致嗜酸性粒细胞增多、杯状细胞增生、气道平滑肌收缩［10］。Th17 在中性粒细胞型哮喘中扮演主要角色，也参与过敏性哮喘的发病过程，在过敏性哮喘中的重要性仅次于Th2。在本研究中，我们发现膳食菊苣酸干预能够有效减少过敏性哮喘小鼠肺部的Th2、Th17 比例，抑制Th2、Th17 细胞分化，并且缓解了小鼠肺部炎症浸润和杯状细胞增生。与之类似的，Tc2 细胞和Tc17细胞在哮喘发病过程中也十分重要［11］，同样在菊苣酸干预后被抑制。尽管Th1和Tc1的比例未发生明显变化，但Th2/Th1免疫平衡仍是向着Th1 优势的方向，也就是恢复正常机体平衡的方向转变，在其他研究中也出现过类似情况［12］。因此，本研究提示菊苣酸可以调节小鼠体内T细胞分化，有效治疗小鼠过敏性哮喘。

Th2 型炎症免疫反应导致的组织中嗜酸性粒细胞炎症也是过敏性哮喘的特性之一，这种嗜酸性粒细胞增多的症状不仅体现在组织当中，还能在病人的血液和痰液中检测到［13］。在哮喘病人的研究中还发现血嗜酸性粒细胞/淋巴细胞比率（ELR）升高，ELR 是一种能够准确预测过敏性哮喘的指标［14］。本研究的结果显示，膳食菊苣酸干预不仅有效降低组织炎症，还能够有效抑制血液中包括嗜酸性粒细胞在内的多种粒细胞浸润，降低ELR。

在亚洲、欧洲，富含菊苣酸的植物如菊苣和紫锥花，被人们用作治疗炎症、传染病、糖尿病的传统草药，而菊苣酸常被用作这类草药产品质量检查的标志物［15］。近年来，越来越多的研究证实了菊苣酸在细胞培养和动物研究中的有益作用，包括抗炎、抗氧化、抗病毒、调节免疫等等。给予过敏性休克模型小鼠20 mg/kg 的菊苣酸口服，能够抑制组胺释放，调节肥大细胞介导的过敏反应［16］，提示菊苣酸是治疗过敏相关炎症的有效药物。在慢性应激小鼠模型中，研究者进一步证实了菊苣酸的免疫调节机制：菊苣酸通过上调CD28和CD80的表达以及下调CTLA-4 来进行免疫刺激，调节小鼠免疫反应和Th1/Th2 稳态［17］，这与本研究中菊苣酸能够调节Th1/Th2/Th17免疫稳态的现象是一致的。

在以往的动物研究中，菊苣酸的干预剂量设置为每天2～60 mg/kg不等。考虑到实验的干预时间、实验动物品种以及疾病模型的特性，本研究将剂量设置为每千克饲料掺入400 mg 菊苣酸进行干预，约相当于给予小鼠每天40 mg/kg的菊苣酸，这个剂量等价于人体每日服用菊苣酸约200 mg［18］，远低于曾在人体研究中使用的剂量［19］。这提示，本研究所使用的菊苣酸剂量，若拓展到人体应用，在理论上是可行的。在大鼠体内进行的代谢动力学研究表明，菊苣酸在血浆中消除速率低，驻留时间长，并且在肺内的浓度仅次于肝脏［20］，推测这可能是菊苣酸在较低浓度下仍能发挥抑制肺部炎症作用的原因。

过敏性哮喘是遗传因素和环境因素共同调控的疾病，发病机制复杂，目前尚无治愈的方法。膳食营养素作为一种安全、有效、经济的手段，不仅有治疗疾病作用，更能融入人群的日常生活当中，从预防的角度来应对复杂的过敏性疾病。因此，本研究欲以膳食营养为基点，为过敏性哮喘提供有效的防治手段，将来，可通过日常摄入富含有益营养素的食物，或开发功能性食品以及膳食补充剂，大大降低过敏性哮喘的发病率和缓解发病症状。

综上所述，本研究首次通过动物体内实验，证实了膳食菊苣酸能有效治疗过敏性哮喘小鼠体内炎症，从膳食营养的角度为防治过敏性哮喘提供了新的思路和理论依据。