气相色谱-质谱联用法测定香米中添加的5,6,7,8-四氢喹喔啉

鲍忠定，王东铭，王 潇

(浙江公正检验中心有限公司，浙江 杭州 310030）

大米作为人们日常主食，因有其高产、稳产、适应性强、经济价值高的优势，在国民经济中占有极其重要的地位。随着居民的收入水平和健康意识的不断提高，消费者对大米食味品质的要求逐渐提高，特别是对口感的要求已从“可以吃”向“是否好吃”转变[1-3]。香米是一种具有特别香型和特殊风味的稻米，深受我国相当数量人口的喜爱，消费需求呈现日益增长的趋势，其价格相对于普通非香米而言常常高出2～3倍[4-5]。

国内外学者从20世纪70年代开始对稻米香味化学组分进行了研究，研究表明香米特征化合物和主要香气贡献物为具有“爆玉米花”香韵的2-乙酰-1-吡咯啉[6-9]。受经济利益驱动，一些不良商家通过在普通大米中添加香米香精以制作“人工香米”以牟取暴利；这种掺杂使假行为不仅损害了消费者的利益并可能造成一定的健康风险，还严重扰乱了市场的正常秩序。2009年 10月卫生部曾发布公告：根据《食品安全法》及其实施条例的规定，大米等粮食生产加工过程中使用香精香料缺乏工艺必要性，大米等粮食生产者不得在生产加工过程中使用香精香料；食品添加剂使用标准GB 2760—2014明确规定：大米中不得添加任何食品用香料、香精[10]。但仍有不法分子为欺骗顾客、扩大销售、牟取暴利在普通大米中加入香米香精，假冒特定品牌的优质大米[11]。

目前对香米中是否添加了香精的分析研究主要有盖崴等[12]利用红外光谱法寻找丙二醇吸收峰定性鉴别是否添加了香精溶剂。冯永巍等[13]通过气相色谱法检测2-乙酰基吡啶对增香大米进行鉴定。孙明哲等[14]采用碘量法测定大米中的香精溶剂 1,2-丙二醇。各种方法均有缺点，2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基吡啶和丙二醇只在部分香米香精中含有。前期研究表明在所购的香米香精样品中都检出5,6,7,8-四氢喹喔啉物质，有部分香米香精样品含有2-乙酰基吡嗪或2-乙酰基吡啶。5,6,7,8-四氢喹喔啉天然微量存在于花生和榛子中，有坚果、烤香、谷物、豆香、小麦香气以及坚果、爆玉米花味道[15]，具有与天然香米特征芳香物质类似的香气。目前国内外还未有对香米中添加的5,6,7,8-四氢喹喔啉的鉴别、分析研究报道，针对大米中添加香米香精，以次充好、以旧充新、冒充品牌的现象，通过测定香米中添加的 5,6,7,8-四氢喹喔啉的含量鉴别香米的真伪，可有效打击大米造假的不法行为，为大米中违法使用香精的监管提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售的5种不同品牌香米（分别以样品A、B、C、D、E表示）；3种稻谷样品样品购于浙江、黑龙江、湖南主产地，品种为中浙优8号、龙稻18和农香32（分别以稻谷1、2、3表示）；5,6,7,8-四氢喹喔啉标准物质（纯度＞98.0%）：日本东京化成工业株式会社；无水乙醇、乙醚（分析纯）：永华化学股份有限公司（江苏）；无水硫酸钠（分析纯）：江苏强盛功能化学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GC 7890B-5977B气相色谱质谱联用仪：美国agilent公司；FY-SXT-06索氏抽提器：杭州菲跃仪器有限公司；DK-S28电热恒温水浴锅、DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；DH5B离心机：湖南多恒仪器设备有限公司；R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；JLG-II型实验砻谷机：中储粮成都粮食储藏科学研究所；LYJM-2型碾米机：郑州良源分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取按其纯度折算为 100%质量的5,6,7,8-四氢喹喔啉标准品100 mg，用无水乙醇溶解，配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于4 ℃棕色瓶中避光保存。根据检测样品中5,6,7,8-四氢喹喔啉的测定要求，用无水乙醇配制成 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0 mg/L的系列标准工作溶液，现用现配。

1.3.2 样品前处理

稻谷样品经过实验砻谷机脱壳处理后，再通过实验室用碾米机进行碾磨处理，得到香米试样备用。将香米试样置于105 ℃电热干燥箱中干燥30 min，冷却后，称取10.0 g香米颗粒样品，用滤纸包裹于索氏抽提器中，由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚至接受瓶内容积的三分之二处，于45 ℃水浴上加热，回流提取2.0 h。取下接收瓶，回流液过无水硫酸钠柱干燥，于 45 ℃水浴中充氮保护旋转浓缩至近干，氮气吹干，用无水乙醇溶解、混合，并定容至2.00 mL。然后在4 000 r/min离心机离心分离5 min，取上清液过0.45 μm滤膜后供气相色谱质谱仪检测分析。

1.3.3 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为 HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.25 mmi.d.×0.25 μm）；进样口温度为230 ℃；载气为高纯氦气；流速为1.0 mL/min（恒流）；柱温初始温度 100 ℃，保持 2 min后，以10 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；分流比15∶1；进样量 1 μL。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电离能量 70 eV；离子源温度 230 ℃；四极杆温度：150 ℃；连接线温度：280 ℃；溶剂延迟时间5.0 min；选择离子采集（SIM）。

2 结果与分析

2.1 定性及定量离子的选择

在选定的前处理条件及色谱-质谱条件下，对样品进行测定。图1、2分别为稻谷、香米试样的GC-MS总离子色谱图（TIC），由图可知，稻谷试样中不含峰 1，香米试样中峰 1能与其它化合物获得有效分离，无干扰峰；保留时间为10.13 min。图 3为峰 1的质谱图，经 NIST谱库检索，与5,6,7,8-四氢喹喔啉标准质谱图匹配（二者之间相似度为90%）。经比较可确定峰1为5,6,7,8-四氢喹喔啉，质核比m/z为106、119、133和134的碎片离子峰是 5,6,7,8-四氢喹喔啉的主要特征离子。采用选择离子监测模式对目标物进行定量时，通常选择灵敏度高、抗干扰能力强的碎片离子为目标离子定量。因此选择5,6,7,8-四氢喹喔啉的定量离子是 m/z 134，定性离子是 m/z 106、119、133。

图1 稻谷样品的总离子流图Fig.1 Total ion chromatography of paddy

图2 香米样品的总离子流图Fig.2 Total ion chromatography of the aromatic rice

图3 峰1质谱图Fig.3 The mass spectrum of peak 1

2.2 前处理条件的优化

5,6,7,8-四氢喹喔啉几乎不溶于水，属于非极性化合物，依据相似相溶原理应选择非极性或弱极性溶剂作为提取剂，选择无水乙醚、无水乙醇、正己烷提取溶剂进行了比较，图4结果表明，选择无水乙醚作为提取溶剂，回收率好，试样基质的干扰少。

图4 不同试样制备和不同提取溶剂5,6,7,8-四氢喹喔啉回收率测定结果Fig.4 Effects of sample preparation and extraction solvent on recovery results of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline

比较选择整粒米和粉碎米作为实验对象，图4结果表明采用整粒米和粉碎米的回收率均达到80%以上，由于粉碎米的米粒太小太轻，对样品的包扎要求严格；此外试样的紧密程度不一，使米粒之间的空隙大小不一，造成抽提速度和试样的重复性测定结果有一定影响；而整粒米由于其表面天然的致密结构，喷雾的香米香精粘附在大米颗粒表面较难渗入内部，故选取整粒米作为实验对象是可行的。

选择0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h等不同的提取时间，考察提取时间对香米中添加的5,6,7,8-四氢喹喔啉提取率的影响；图5结果表明抽提时间控制在2.0 h，既能保证目标物的有效提取，又能减少试样中脂溶性成分的提取。

图5 不同提取时间5,6,7,8-四氢喹喔啉回收率测定结果Fig.5 Effects of the extraction time on recovery results of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline

2.3 线性关系、检出限

取 5,6,7,8-四氢喹喔啉标准系列工作溶液（1.3.1）按照1.3.3所述的色谱和质谱条件进行分析，以目标物峰面积对应目标物浓度（mg/L）进行回归分析，结果表明 5,6,7,8-四氢喹喔啉在0.5～10.0 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，线性关系R为0.999 4；以3倍信噪比确定方法的检出限为0.05 mg/L。

2.4 方法精密度、回收率

平行测定6份供试香米样品，在上述分析条件下测定香米中5,6,7,8-四氢喹喔啉的含量，以考察方法的精密度。结果表明，6份供试样品中5,6,7,8-四氢喹喔啉的含量分别为 0.269、0.283、0.294、0.271、0.297和0.266 mg/kg，相对标准偏差（RSD，n=6）为4.77%。以上述供试香米样品和稻谷为代表基质，分别在3个水平下进行加标回收实验，考察方法的准确度。其测定结果见表1所示，香米试样和稻谷的加标回收率在81.00%～93.70%与 80.00%～92.80%之间，结果表明方法在低、中、高浓度5,6,7,8-四氢喹喔啉检测上能保证相应的准确度，完全满足日常分析检测的要求。

表1 5,6,7,8-四氢喹喔啉回收率测试结果（n=6）Table 1 Recovery results of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline (n=6)

2.5 实际样品测试

应用建立的方法对市售的稻谷和香米中5,6,7,8-四氢喹喔啉进行测定，测定结果见表 2。由表2结果可见，稻谷样品不含有5,6,7,8-四氢喹喔啉；有1批次市售的香米中检出5,6,7,8-四氢喹喔啉（0.12 mg/kg），样品测试结果质谱图和质谱确认图如图6、7所示，应是常规大米人为加入了香米香精，以冒充香米进行暴利销售，结果表明该方法是一种有效鉴别香米真伪的方法。

表2 样品中5,6,7,8-四氢喹喔啉的含量Table 2 The content of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline in the samples

图6 样品D中5,6,7,8-四氢喹喔啉的选择离子监测质谱图Fig.6 The selective ion monitoring mass spectrum of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxalinethe in sample D

图7 5,6,7,8-四氢喹喔啉的定量和定性离子的质谱确认图Fig.7 The conclusive diagram of quantitative and qualitative ion of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxalinethe

3 结论

本研究建立了测定香米中添加的 5,6,7,8-四氢喹喔啉的气相色谱-质谱检测方法。香米试样经索氏提取和净化，根据保留时间和质谱定性，外标法定量。通过对方法回收率、精密度等方法学指标的研究，表明方法具有较高的回收率、精密度和灵敏度，适用于香米的快速定性测定及真伪鉴别，为大米中违法使用香精的监管提供科学参考和分析技术手段。