QuEChERS结合GC-MS/MS法快速测定小麦中20种农药残留量

彭星星，高海军，尹成华

（1. 河南省粮油饲料产品质量监督检验中心，河南 郑州 450004；2. 河南省粮食科学研究所有限公司，河南 郑州 450004）

小麦作为人类的主食之一，小麦粉可用于制作馒头、面条等食物，是我国千家万户最重要的口粮来源。近年来由于环境污染、气候异常等原因造成的病虫害多发现象，使得原本用于经济作物上的杀虫剂等农药在粮食作物上的使用也开始泛滥起来[1-4]，从而出现粮食中农药残留量检测超标的情况。粮食中的农药残留问题越来越受到大家的关注，许多国家都制定了严格的农药残留限量标准[5-6]。目前有研究以 QuEChERS方法净化结合GC-MS/MS检测的方法[7-10]对蔬菜、水果、中药材、食用菌中农药残留量进行了测定，建立了高通量同时检测多种农药残留量的方法。

小麦中所用农药种类繁多，包括常见的有机磷类如地虫硫磷、毒死蜱等，氨基甲酸酯类如仲丁威、抗蚜威等，有机氯类如艾氏剂等，还有菊酯类农药如联苯菊酯等。本实验在GB 23200.113—2018《食品安全国家标准 植物源性食品中 208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》[11]的方法基础上，以QuEChERS方法为基础提取小麦中的农药，且对其中净化吸附剂的种类和含量进行了优化，并结合运用气相色谱-串联四极杆质谱（GC-MS/MS）技术分析其中20种常见农药残留量的方法，通过建立标准曲线、分析回收率及基质效应等方式建立一种简单、快速、准确、高通量测定小麦中不同种类农药残留量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验方法中的小麦均来自河南省各地市的抽查样品，密封冷藏待测。

1.2 仪器与设备

气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪：SCION TQ/456GC型，德国布鲁克公司；电子分析天平：BS2000S型，感量为 0.01 g，北京赛多利斯仪器系统有限公司；台式高速离心机：TG16.5型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；双功能水浴恒温振荡器：HZ-9212S型，上海康华生化仪器制造有限公司；水浴氮吹仪：MTN-2800型，上海旌派仪器有限公司；中央纯水装置：Centra R120型，英国ELGA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备

取小麦样品 500 g，粉碎后使其全部可通过425 μm的标准网筛，放入袋中密封保存。

1.3.2 样品前处理方法

参考GB 23200.113—2018中7.1.2前处理方法，具体操作步骤为：准确称取 5 g样品置于50 mL的塑料离心管中，加入10 mL水涡旋混匀，然后加入 15 mL（体积比为 99∶1）乙腈醋酸溶液，涡旋混匀，加入1.5 g醋酸钠使乙腈层与水层分离开来，上层为乙腈层，再加入6 g无水硫酸镁剧烈振荡 1 min使其除去乙腈层中的水分，4 200 r/min离心5 min，得上清液。依次称取0.4 g无水硫酸镁、0.1 g PSA、0.2 g C18和0.1 g GCB于15 mL离心管中，加入8 mL上清液，置于垂直涡旋振荡器上涡旋混匀1 min，4 200 r/min离心5 min，吸取2 mL上清液于5 mL试管中，氮吹后加入20 μL内标和1 mL乙酸乙酯涡旋混匀，过0.22 μm有机滤膜。

1.3.3 标准溶液制备

用乙酸乙酯将质量浓度为 100.0 μg/mL环氧七氯B标液稀释为5.0 μg/mL的内标溶液。

用乙酸乙酯将质量浓度为100.0 μg/mL的20种农药目标物稀释成5.0 μg/mL的混合标准工作液。然后用乙酸乙酯进行逐级稀释制得质量浓度分别为5、10、50、100、500 ng/mL的系列混合标准工作液。空白基质溶液氮气吹干，分别加入1.0 mL系列混合标准工作液复溶，加入20 μL内标溶液，混匀，配制成系列基质混合标准工作液。

1.3.4 色谱仪条件

进样口温度设为 250 ℃；色谱柱选择 DB-5 MS毛细管型（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序如下所示：

1.3.5 质谱仪条件

质谱仪参数设置如表1所示。

表1 质谱仪参数设置Table 1 The parameter settings of mass spectrometer

1.4 数据分析

应用 WPS office（11.1.010463）软件对实验中数据进行公式拟合和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 净化条件的选择

本实验选用乙腈作为提取溶剂[12]。小麦中含有大量丰富的有机物质，比如淀粉、蛋白质、脂肪、维生素、膳食纤维等复杂的有机物，仅仅使用单一的吸附剂不能产生明显的净化效果。无水MgSO4的作用是能够吸附乙腈层中剩余的水分，同时无水MgSO4也能够降低乙腈层的极性[13]。溶液萃取常用的净化剂包括PSA、C18和GCB。其中PSA的作用是吸附存在于小麦基质溶液中的大多数有机物质如碳水化合物、有机酸类、脂肪酸类和酚类，另外也可吸附溶液中少量的色素[14-16]；C18的作用是吸附存在于小麦基质溶液中的脂肪以及酯类等非极性的干扰物质[17]，这样可以避免非极性物质的干扰；GCB的作用是吸附存在于小麦基质溶液中的色素[18]，使净化液澄清透明无色。另外有研究表明，C18或GCB与PSA同时使用能够明显降低溶液的基质效应[19]。当然，这几种净化剂除了能够去除基质中杂质以外，也可能会对基质中的某些目标化合物产生吸附作用。以仲丁威、灭线磷、异草酮和草酮为例来考察不同净化条件对其回收率的影响效果，结果如图1～4所示。

在 80.0 μg/kg农药添加水平下考察无水MgSO4、PSA、C18和GCB添加量对仲丁威、灭线磷、异草酮和草酮回收率的影响。由图 1可知，在 PSA添加量为 400 mg、C18添加量为400 mg、GCB添加量为200 mg时，当无水MgSO4使用量为400 mg时，4种农药回收率达到最高值，随着无水 MgSO4使用量的增多四种农药回收率反而有所降低，因此确定无水 MgSO4使用量为400 mg。由图 2可知，在无水 MgSO4添加量为1 200 mg、C18添加量为400 mg、GCB添加量为200 mg时，当PSA使用量为100 mg时，这4种农药的回收率均达到最大值，随着PSA用量越来越大，4种农药回收率反而有所降低，因此确定PSA添加量为100 mg。由图3可知，在无水MgSO4添加量为1 200 mg、PSA添加量为400 mg、GCB添加量为200 mg时，当C18添加量为200 mg时四种农药的回收率达到最高值，当C18用量变大时，4种农药回收率有所降低，因此确定C18添加量为200 mg。由图4可知，在无水MgSO4添加量为1 200 mg、PSA添加量为400 mg、C18添加量为400 mg时，当GCB用量变大时，提取液褪色更明显，但四种农药的回收率明显降低，因此确定GCB添加量为100 mg。

图1 无水硫酸镁对4种农药回收率的影响Fig.1 The effect of MgSO4 on the recovery of four pesticides

图2 PSA对4种农药回收率的影响Fig. 2 The effect of PSA on the recovery of four pesticides

图3 C18对4种农药回收率的影响Fig.3 The effect of C18 on the recovery of four pesticides

图4 GCB对4种农药回收率的影响Fig.4 The effect of GCB on the recovery of four pesticides

通过实验优化，最终选择 400 mg无水MgSO4、100 mg PSA、200 mg C18与 100 mg GCB作为净化吸附剂对提取溶液进行净化。

2.2 质谱条件优化

质谱参数采取正离子模式，对20种目标物和内标环氧七氯B在m/z 50～500的范围内采用Scan（全扫描模式）进样，得到TIC图，再使用质谱软件标准库进行化合物检索，采用 Product模式（子离子扫描方式）得到子离子碎片，然后在5～40 eV范围内通过改变特征离子电压的方式对碰撞电压进行优化，以此来建立 MRM（多反应监测模式）方法。20种农药的MRM相关参数结果如表2所示，加入内标环氧七氯B的小麦基质空白谱图如图5所示，用小麦基质溶液配制的20种混标（100 ng/mL）和内标环氧七氯B的MRM色谱图如图6所示。

图5 加入内标环氧七氯B小麦空白基质总离子流图Fig.5 Total ion current chromatogram of heptachlor epoxide B in wheat shoot matrix

图6 20种农药及内标环氧七氯B在小麦基质中总离子流图Fig.6 Total ion current chromatogram of 20 pesticides and heptachlor epoxide B in wheat shoot matrix

表2 20种农药及内标的保留时间、定量离子对、定性离子对与碰撞能量结果Table 2 Retention time, qualitative ions,quantitative ions and collision energy of the 20 pesticides

续表2

从图5～6可以看出，小麦空白样品中的基质干扰较大，有较多的杂峰。用小麦空白基质配制的20种农药混合标准溶液峰型较好，各农药化合物均完全分离。实验采用多反应离子监测模式（MRM）进行质谱检测，有效地避免了小麦基质中出现假阳性的情况。

2.3 标准曲线方程与基质效应

20种农药混标用小麦空白基质溶液配制成5～500 ng/mL的梯度标液，按照优化后的仪器条件上机。测定结果采用内标法进行定量分析，以各农药化合物与内标物质量浓度比（X）为横坐标，农药化合物与内标物峰面积比（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。参照朱海花等[20]的方法，取0.08 mg/kg加标水平的样品进行分析，测定信噪比，分别以每种农药3倍、10倍信噪比（S/N）计算检出限和定量限，结果见表3。

由表 3可知，20种农药的相关系数均大于0.990，检出限在 0.01～0.16 μg/kg范围内，定量限在 0.04～0.52 μg/kg 范围内。

表3 20种农药的校准曲线、相关系数、检出限、定量限、基质效应、回收率及相对标准偏差Table 3 Calibration curve, R2, limits of detection, limits of quantitation, matrix effect, recoveries and relative standard deviations of 20 pesticides

在气相色谱-质谱分析中往往会存在基质效应[21]。分别采用小麦基质溶液和乙酸乙酯溶剂配制系列标液，建立两组校准曲线，计算基质效应强度 ME。ME（%）=[（基质匹配校准曲线的斜率/溶剂校准曲线的斜率）- 1]×100，ME＜-50%或者ME＞+ 50%为强基质效应，-20%＜ME＜+20%为弱基质效应，-50%≤ME≤-20%或者+20%≤ME≤+50%为中等基质效应[22-23]。结果表明：除克百威、野麦畏、艾氏剂、草酮及联苯菊酯 5种农药基质效应较弱外，异丙威、敌敌畏、灭线磷、异草酮、地虫硫磷、抗蚜威、嗪草酮、甲霜灵、甲基嘧啶磷、氟酰胺及甲氰菊酯11种农药出现中等强度的基质效应，仲丁威、二甲戊灵、多效唑及环丙唑醇4种农药出现强基质效应。综上可知，为了防止本实验中20种目标物农药的基质效应对测定结果产生较大的影响，同时也为了提高测定结果的准确性，本实验采取小麦基质溶液配制20种目标化合物的校准曲线。

2.4 重复性和准确性

取同样空白的小麦样品5.00 g，20种农药添加水平分别为80.0、200.0和400.0 μg/kg下做加标实验，平行进样6次，计算平均回收率，再通过标准偏差与平均回收率的比值来计算相对标准偏差（RSD）。如表3所示，在添加水平为80 μg/kg时，20种农药平均回收率在75.24%～98.29%范围内，RSD为0.57%～3.13%；添加水平为200 μg/kg时，20种农药平均回收率在 82.01%～105.71%范围内，RSD为0.67%～3.98%；添加水平为400 μg/kg时，20种农药平均回收率在 94.91%～106.14%范围内，RSD为1.26%～3.08%。由此可见方法的重复性和准确性良好，能够满足实验中20种农药残留量的分析测试要求。

2.5 实际样品分析

以本实验方法对抽查的 370份小麦安全监测样品进行测定，其中两份样品检出克百威，残留量分别为0.040和0.033 mg/kg，一份样品检出灭线磷，残留量为0.042 mg/kg。根据GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[24]判定，克百威和灭线磷的残留量均未超标。

3 结论

本实验建立了 QuEChERS结合气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS），采用多反应监测（MRM）模式，内标法定量检测小麦中20种农药残留量的方法。与GB 23200.113—2018中7.1.2前处理方法相比，本方法通过对净化吸附剂的优化，节约了无水MgSO4、PSA、C18的用量，将无水MgSO4添加量从1 200 mg减少到了400 mg，将PSA的添加量从400 mg减少到了100 mg，将C18的添加量从400 mg减少到了200 mg；另外本方法加入了100 mg GCB，可以有效去除小麦提取液中的色素。

20种农药在 GC-MS/MS上的响应值与其质量浓度线性关系良好，相关系数超过 0.99，检出限范围是 0.01～0.16 μg/kg，定量限范围是 0.04～0.52 μg/kg。除克百威、野麦畏、艾氏剂、草酮及联苯菊酯5种农药基质效应较弱外，异丙威、敌敌畏、灭线磷、异草酮、地虫硫磷、抗蚜威、嗪草酮、甲霜灵、甲基嘧啶磷、氟酰胺及甲氰菊酯11种农药的基质效应为中等强度，仲丁威、二甲戊灵、多效唑及环丙唑醇4种农药出现强基质效应。因此，为了提高20种农药测定结果的准确性，本实验采取基质配制标准工作液对标准曲线进行校正。

在添加水平为80 μg/kg时，20种农药平均回收率在 75.24%～98.29%范围内，RSD 为 0.57%～3.13%；添加水平为200 μg/kg时，20种农药平均回收率在82.01%～105.71%范围内，RSD为0.67%～3.98%；添加水平为400 μg/kg时，20种农药平均回收率在94.91%～106.14%范围内，RSD为1.26%～3.08%。该方法适合批量前处理，准确度、重复性和灵敏度均能够达到农药多残留检测的技术要求，可以用于小麦中20种农药残留量的检测。