过表达HGF 基因AAV9 型腺相关病毒载体的构建与鉴定

王秋实， 孙 岳， 刘太阳， 宝 瑞， 郝 玮， 刘耀阳，李媛媛， 畅思容， 王 梦， 刘志宏

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004； 2.国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，银川 750004）

随着我国社会快速发展，职业病成为一个不容忽视的问题。2019年，在职业病人群中尘肺患者占90%以上[1]。尘肺是以肺组织弥漫性纤维化为主的疾病，目前临床上仍缺乏有效的治疗手段。因此，寻找有效治疗肺纤维化的药物是尘肺治疗的迫切需要。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）由分子质量分别为69 kD 的α 链和34 kD 的β 链以二硫键连接而成，是一种刺激肝细胞增殖的促有丝分裂因子，是目前已知最强烈的肝细胞增殖刺激因子[2]。HGF 在许多组织中局部表达，包括肺、肾和肝脏，并可以促进正常组织再生，防止肺、心、肾和肝的纤维化重塑[3]。HGF在调节炎性反应[4]和伤口修复能力[5]，减轻刺激诱导的上皮间质转化和Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡[6]，以及抑制肌成纤维细胞分化和细胞外基质的产生[7]中起关键作用。研究[8]表明，HGF 在肺损伤后升高。从受损肺中提取的支气管肺泡液中HGF蛋白水平升高[9]。尽管HGF 在组织损伤后增加，但在包括肺在内的几种组织中，HGF 在纤维化的发展和（或）进展过程中的表达与HGF 的表达呈负相关[3]。因此，在肺纤维化疾病的发生发展过程中，HGF 发挥了重要作用，并且可作为一个潜在的治疗靶点。

目前，尘肺的发病机制尚不明确，且临床上缺乏有效的治疗措施来逆转尘肺纤维化病变或减缓病变的进展[10-11]。相较于传统治疗方法，基因治疗可通过导入正常基因或编辑修复缺陷基因，实现对疾病的根源性治疗。腺相关病毒由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长等特点被视为最有前途的基因治疗手段，得到广泛应用。有研究[12]表明，AAV9 腺相关病毒在全身用药后在病毒基因组分布和蛋白表达方面更具优势。因此，本研究利用AAV9 腺相关病毒优势，构建过表达HGF 基因的AAV9 腺相关病毒载体，为后续HGF 在体内外的过表达研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 宁夏医科大学实验动物中心提供体质量为20～24 g、6～8 周龄C57BL/6 雄性小鼠，所有实验动物均符合动物伦理委员会的要求（伦理号：2020-493）。

1.1.2 主要试剂及细胞株 质粒pAAV-ITRCMV、DH5α 感受态细胞、2×Taq MasterMix、DNA Ligase、DNA Marker、DNA 测序由北京合生基因科技有限公司进行并完成；质粒小量快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Omega 公司；限制性内切酶XhoⅠ购自美国NEB 公司；DNA 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；LB 培养基购自Solarbio 公司；CPT 高效转染试剂盒购自美国Millipore 公司；总RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；293FT 细胞购自美国Thermo Fisher公司；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Invitrogen 公司；HGF、β-actin 抗体购自美国SANTA 公司；辣根过氧化氢酶标记二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；Affinity ECL KIT购自江苏亲科生物研究中心有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腺相关病毒载体构建 美国国家生物技术信息中心（NCBI）查找野生型小鼠HGF 基因序列（HGF，NM_001289458），根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物。目的基因两端设计有XhoⅠ连接位点。将扩增得到的野生型小鼠HGF基因片段使用DNA Ligase 连接至pAAV-ITRCMV 质粒上获得pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因（图1）。将pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF质粒与解冻后的DH5α 感受态细胞混匀冰浴30 min，42 ℃水浴60 s，冰浴2 min，加入不含抗生素的LB培养基37 ℃摇床振荡45 min 后于含抗生素的LB 培养基上37 ℃培养12 h。筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，XhoⅠ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序引物见表1。

表1 RT-qPCR 扩增引物序列

图1 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 过表达质粒图谱

1.2.2 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 腺相关病毒包装 病毒包装前将（3～5）×106个293FT 细胞传代接种，培养16～24 h。按照CPT 高效转染试剂盒说明书，将含有pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 的转染体系均匀加入接种293FT 细胞的培养皿中，轻微水平振荡培养皿以混匀培养6 h，将培养基更换为37 ℃水浴预热的新鲜完全培养基。转染72 h 后，观察荧光并拍照，判断转染效率并收集细胞。收集的细胞用PBS 重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15 000 r·min-1离心30 min，取上清。细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，PBS 超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液。

1.2.3 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 病毒滴度测定 取6 μL 纯化后的重组腺相关病毒，去除DNA 污染并裂解病毒得到其基因组DNA。然后进行qRT-PCR 检测，检测对象为腺相关病毒载体上的WPRE 序列，上游引物为F:5’- CCGTTTCA GGCAACGTG-3’；R:5’-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3’。pAAV-EGFP 质粒按10、102、103、104和105稀释后作标准曲线。qRT-PCR 反应体系为20 μL：2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物为10 μmol·L-1各0.8 μL，2 μL 纯化的病毒液，ddH2O补足至20 μL。反应条件为95 ℃30 s、95 ℃5 s、60 ℃34 s，40 个循环。每个样品设定3 个重复测定管。根据标准曲线计算病毒滴度。

1.2.4 动物模型构建 将18 只C57BL/6 雄性小鼠随机分为3 组，分别为生理盐水组、过表达组与阴性对照组。过表达组与阴性对照组通过颈静脉分别注射AAV-HGF 与AAV-EGFP 病毒，病毒注射量为2.61×1011vg·kg-1，生理盐水组注射同等体积的生理盐水。

1.2.5 Western blot 实验 准确称取肺组织30 mg，加入1 mL Lysis Buffer，匀浆仪匀浆，按说明书提取蛋白。用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。取适量5×Loading Buffer 混匀，100 ℃5 min 使蛋白变性，用SDS-PAGE 凝胶电泳，每孔准确加入30 μg蛋白，浓缩胶恒压80 V，蛋白跑至分离胶后转恒压120 V；湿式转入聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，将PVDF 膜放入5% 脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，摇床4 ℃一抗孵育过夜，洗膜后加入二抗孵育2 h，使用PBST 漂洗3 次，10 min/次。将PVDF 膜放入ECL 化学发光液中使其充分反应并检测蛋白条带，计算目标蛋白条带灰度与内参（β-actin）条带灰度之间的比值，即代表目标蛋白的相对含量。各组实验重复3 次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 质粒酶切鉴定

利用PCR 获取HGF 的目的基因，与pAAVITR-CMV 质粒XhoⅠ单酶切产物相连接构建形成重组质粒pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，分别在2.5 kb 和5.0 kb 附近有单一的目的条带，产物片段大小与预期大小一致（图2）。测序结果与设计序列一致（图3），证明病毒载体构建成功。

图2 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 过表达质粒酶切鉴定图

图3 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 过表达质粒测序图

2.2 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 病毒包装纯化及滴度检测

pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 转染体系与293FT 细胞共培养后，倒置显微镜下观察，显示细胞生长状态良好，胞浆透亮，胞核隐约可见。荧光倒置显微镜下观察到293FT 细胞发绿色荧光，表明腺相关病毒包装成功（图4）。纯化后使用PCR 法测定AAV9-HGF 病毒滴度为5.22×1012vg·mL-1，可以满足接下来的体内外实验需求。

图4 pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF 质粒转染293FT 细胞图

2.3 小鼠肺组织中HGF 蛋白的表达

通过颈静脉注射给予小鼠pAAV-ITR-CMVAAV9-HGF 过表达病毒后，采用Western blot 检测发现小鼠肺组织中过表达组HGF 蛋白相对表达水平（1.60±0.21）较生理盐水组（0.45±0.13）和阴性对照组（0.69±0.24）均升高，差异均有统计学意义（P 均<0.01）（图5）。表明构建的病毒载体在动物肺组织中高表达HGF。

图5 各组小鼠肺组织中HGF 蛋白相对表达含量（n=6）

3 讨论

基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段[13]。目前，以HGF 为靶点的基因治疗在多种疾病中证实有效。在兔角膜纤维化模型中，局部BMP7 联合HGF 基因治疗可治疗角膜纤维化并在体内恢复透明性，减轻肌成纤维细胞的过度愈合和选择性凋亡[14]。研究[15]表明，肌内注射裸露的HGF 质粒有助于改善下肢缺血患者的静息疼痛，并显著减少缺血性溃疡的面积。对重症下肢缺血合并糖尿病患者腺病毒肌内注射含有HGF 与血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的双顺反子质粒，患者无严重并发症、疼痛减轻，并且有新的侧支血管形成[16]。在小鼠坐骨神经挤压模型中，肌肉注射rAAV6-HGF 可减轻机械性痛觉超敏程度，增加肌纤维横截面积，改善运动功能，表明肌肉注射rAAV6-HGF 可能用于缓解大多数肌肉疾病中与肌肉萎缩、神经损害相关的各种症状[17]。目前我国已批准过表达HGF 腺病毒用于冠心病患者的Ⅰ期安全性研究[18]。

在动物肺纤维化疾病模型中，应用HGF 蛋白可以预防几种肺纤维化疾病的纤维化重塑[19]。使用非病毒质粒在体内瞬时表达HGF 可以防止纤维化的肺重塑。利用白蛋白衍生的颗粒转染肺内皮细胞，体内瞬时转染HGF 可增加小鼠的修复并防止胶原沉积和重塑[20-21]。因为HGF 是分泌的，所以“非疾病的器官靶向基因转移”也可以用来产生HGF 蛋白，然后通过循环系统到达肺部[22]。因此将HGF 编码的质粒电转移到肌肉组织中也被证明可以抑制博来霉素诱导的小鼠纤维化重塑[22]。更为重要的是，当HGF 蛋白与促纤维化治疗同时给予或在给予促纤维化治疗7 d 后给予HGF 蛋白时具有保护作用，表明HGF 在疾病的初始阶段和进展阶段都是有效的[23]。

为更好地研究HGF 在肺纤维化疾病中所发挥的作用并探索可能的治疗策略，本研究设计并合成了HGF 基因的CDS 全序列，并选用AAV9作为基因表达载体，使其免疫原性降低，提高了安全性。质粒酶切鉴定与基因插入区域测序比对鉴定结果显示重组质粒构建成功。经过病毒包装及滴度测定获得了较高滴度的过表达HGF 重组腺相关病毒。该病毒转染293FT 细胞后可以观察到绿色荧光蛋白，证明病毒载体具有高效转染细胞的能力。通过颈静脉注射给予小鼠该病毒后发现小鼠HGF 蛋白表达升高，说明过表达HGF 重组腺相关病毒在体内可以发挥作用并使HGF 蛋白高表达。综上所述，本研究结果为后续HGF 基因在体内外的过表达研究奠定了基础，可能为治疗肺纤维化疾病提供一定的理论参考。