弓形虫Ⅱ型ROP16 蛋白对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎性反应的影响

党甜甜， 贾 伟， 陈 梅， 潘亚菲， 杨宁爱， 康宇婷，苏雅静， 汪澎涛， 赵志军

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学病原微生物重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004）

弓形虫是一种具有复杂的生命周期，可感染人类和多种温血动物的专性胞内寄生虫[1]。免疫功能低下的人群感染弓形虫会引起多种疾病，如HIV、癌症等，同时会通过胎盘经垂直传播导致孕妇流产[2]。在入侵宿主细胞过程中，弓形虫的顶端复合体发挥着重要的作用，而研究最为深入的是其棒状体，与其发病机制、宿主细胞入侵和与宿主细胞相互作用等密切相关。棒状体蛋白（rhoptry proteins，ROP）家族是T.gondii 特异性蛋白，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP16 和ROP18 等，其中ROP16 是关键的毒力决定因子，可在寄生虫感染后迅速侵入宿主细胞核[3-5]。巨噬细胞表现出高度的可塑性，根据刺激信号采取不同的激活状态，从而保护组织稳态并调节炎性反应，对组织内的微环境因子作出反应。分化为两种不同的功能表型：M1 型表达诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要分泌白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子，M2 型表达精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1），主要分泌IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）等抑炎因子[6]。微环境中的LPS 与巨噬细胞表面TLR4 结合，作用于核转录因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）和干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3），促进巨噬细胞M1 型的极化，分泌促炎因子。Ⅱ型弓形虫分泌的蛋白会使NF-κB 发生磷酸化而诱导巨噬细胞偏向M1 型极化[6-8]。信号转导与转录激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）受γ 干扰素（γ interferon，IFN-γ）受体刺激后二聚体化，以二聚体的形式进入宿主细胞核中，与编码iNOS、IL-12 等基因中的序列结合，调控M1 型巨噬细胞的极化[8]。

基于以上研究，本研究拟使用大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 作为模型来探讨Ⅱ型弓形虫ROP16对NR8383 巨噬细胞炎性反应的影响。通过构建Ⅱ型弓形虫ROP16 过表达载体，转染NR8383 细胞后，利用免疫荧光法确定ROP16 在NR8383 细胞中的定位情况，采用RT-PCR、Western blot 和ELISA 检测相关基因和蛋白表达情况，探讨Ⅱ型弓形虫ROP16 蛋白对NR8383 炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

NR8383 细胞保存于宁夏临床病原微生物重点实验室；嘌呤霉素购自Sigma 公司；实验所用慢病毒（空载体pHBLV-CMV 和ROP16 过表达载体pHBLV-CMV ROP16）均购自汉恒生物科技（上海）有限公司；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa 公司。鼠抗Arg-1 购自美国Proteintech 公司，鼠抗His-tag、兔抗iNOS、HRP 标记山羊抗兔IgG（HRP-IgG）、山羊抗鼠IgG（HRP-IgG）均购自美国Abcam 公司，兔抗NF-κB、磷酸化核转录因子κB（phosphorylated nuclear transcription factor κB，P-NF-κB）、STAT1、磷酸化转录活化蛋白1（phosphorylated transcription activating protein 1，P-STAT1）均购自CST 公司。酶联免疫吸附测定试剂盒购自江莱生物科技有限公司。RT-PCR 所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将NR8383 细胞从-150 ℃冰箱取出后，于37 ℃水浴箱中快速融化，并使用含20% FBS 的F-12K 培养液，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时进行传代，传代3 次后的细胞用于后续实验。

1.2.2 ROP16 过表达稳转细胞株构建 将对数生长期的NR8383 细胞按1×104个/孔接种于96孔板，每孔加入100 μL 细胞悬液。分组设置为空白对照组（正常NR8383 细胞）、空载组（pHBLVCMV）和ROP16 过表达组（pHBLV-CMV ROP16）。按照说明书，向96 孔板中加入慢病毒，细胞培养箱中培养72 h 后，于荧光显微镜下观察结果。之后细胞培养密度达到80%时，用嘌呤霉素（1 μg·mL-1）筛选，得到稳转细胞系，即可用于后续检测。

1.2.3 蛋白免疫印迹检测各组NR8383 细胞相关蛋白的表达 收集细胞密度80%～90%时的空白对照组、空载组、ROP16 过表达组细胞，通过BCA 蛋白提取试剂盒提取全蛋白并检测相应蛋白浓度。配制7.5%浓缩胶、5%分离胶，根据蛋白浓度进行上样，通过电泳、转膜、封闭、一抗4 ℃过夜、二抗室温孵育后，配制显色液（1∶1），以凝胶成像系统观察结果，分析条带灰度值，以βactin 作为内参。

1.2.4 免疫荧光检测ROP16 蛋白在NR8383 细胞中的定位 将细胞爬片放置在24 孔板内，滴加细胞悬液，放置培养箱培养24 h 后，经过细胞固定、打孔以及封闭，加入Mouse monoclonal［HIS.H8］to 6X His tag抗体（Abcam，美国），4 ℃过夜，48 h 后，加入CY3 抗兔荧光二抗，细胞核染色（DAPI），封片，于激光共聚焦显微镜下观察结果。

1.2.5 RT-PCR 法检测各组NR8383 细胞ROP16及相关炎性因子的表达 Trizol 法分别提取空白对照组、空载组及ROP16 过表达组的总RNA后，反转录为cDNA，RT-PCR 法检测相关基因相对表达含量。20 μL 反应体系: cDNA 模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，TB Green Premix EX TaqTMⅡ10 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件: 预变性95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，45 个循环。采用2－△△Ct法分析目标基因mRNA 水平的相对变化。其中，每组设置3 个平行孔，取平均值，见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.2.6 ELISA 法检测各组NR8383 细胞培养上清液的炎性因子含量 收集空白对照组、空载组及ROP16 过表达组细胞培养上清液，根据说明书操作步骤，检测每组细胞上清液中炎性因子的含量。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行数据分析。所有实验重复3 次，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达ROP16 慢病毒转染NR8383 细胞结果

在荧光显微镜下观察发现，空载组和ROP16过表达组均带有绿色荧光，表明空载组和ROP16过表达组稳定株构建成功，见图1。

图1 过表达ROP16 慢病毒转染NR8383 细胞荧光表达情况（HE×20）

2.2 转染NR8383 细胞中ROP16 过表达的鉴定

RT-PCR 检测结果显示，ROP16 过表达组ROP16 mRNA 表达高于空白对照组（P<0.01）；Western blot 结果显示，ROP16 过表达组中出现单一目的条带，分子质量为96 kDa，符合ROP16蛋白预期大小，即ROP16 蛋白成功表达于NR8383细胞中；空白对照组和空载组中均未出现单一目的条带，见图2。

图2 RT-PCR、Western blot 检测NR8383 细胞中ROP16 mRNA 及蛋白的表达

2.3 ROP16 蛋白在NR8383 细胞中的定位

免疫荧光结果显示，空白对照组和空载组均未出现红色荧光，ROP16 过表达组出现红色荧光。融合后发现ROP16 信号与细胞核重叠，聚集在细胞核中，即ROP16 过表达后定位于NR8383的细胞核中，见图3。

图3 免疫荧光确定ROP16 蛋白在NR8383细胞的定位（HE×600）

2.4 相关因子mRNA 及蛋白水平的检测

RT-PCR 结果显示，空白对照组与空载组之间各指标差异均无统计学意义（P 均>0.05），与空白对照组相比，ROP16 过表达组M1 型关键因子iNOS 和CD86 mRNA 的表达均增高（P 均<0.01），而M2 型关键因子Arg-1 和CD206 mRNA 的表达均降低（P 均<0.05），见图4；Western blot 结果显示，与空白对照组相比，ROP16 过表达组iNOS、M1 型 通 路 蛋 白NF-κB、P-NF-κB、STAT1、PSTAT1 蛋白的表达均增高（P 均<0.05），M2 型关键分子Arg-1 的表达降低（P<0.05），见图5。

图4 RT-PCR 检测各组NR8383 细胞iNOS、CD86、Arg-1 与CD206 的mRNA 表达

图5 Western blot 检测各组NR8383 细胞极化相关蛋白的表达

2.5 RT-PCR 检测各组NR8383 细胞相关炎性因子的表达

RT-PCR 结果显示，ROP16 过表达组中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 mRNA 表达水平均高于空白对照组（P 均<0.01），而抗炎因子TGF-β 和IL-10 mRNA 表达水平均低于空白对照组（P 均<0.01），空白对照组与空载组之间各指标差异均无统计学意义（P 均>0.05），见图6。

图6 RT-PCR 检测各组NR8383 细胞炎性相关因子mRNA 的表达

2.6 ELISA 检测各组NR8383 细胞上清中相关炎性因子的变化

ELISA 结果显示，ROP16 过表达组促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 的含量均高于空白对照组（P 均<0.05），而抗炎因子TGF-β 和IL-10的含量均低于空白对照组（P 均<0.05），见图7。

图7 ELISA 检测各组NR8383 细胞上清炎性因子的含量

3 讨论

弓形虫感染后，转化为快速复制的速殖子，在宿主中传播，引起人兽共患的弓形虫疾病[9-10]。弓形虫的分泌蛋白可调控宿主的免疫反应，具有酪氨酸激酶活性的ROP16 会借助核定位结构（NLS）转运至宿主细胞核内，最终影响宿主细胞的表达[11]。ROP16 可通过调控因子IFN-γ 诱导NO 的生成，调控宿主对弓形虫的抑制作用，还可以通过基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导细胞因子的合成，参与调控宿主细胞，目前广泛应用于弓形虫疫苗的研究[12]。目前关于ROP16 基因过表达大鼠肺泡巨噬细胞的研究报道极少，因此，本文研究ROP16 调节大鼠肺泡巨噬细胞极化及其作用机制有积极作用。巨噬细胞根据对环境反应的不同，分为经典激活的巨噬细胞M1 和替代激活的巨噬细胞M2 两种不同的表型。M1 型巨噬细胞主要分泌IL-1β、IL-12、IL-6、IL-23、TNF-α 等促炎因子，起促进炎症的作用；M2 型巨噬细胞主要分泌IL-10、TGF-β、IL-4 等抑炎因子，起抑制炎症发生的作用。在正常状态下，M1 型细胞分泌的促炎因子与M2 型分泌的抑炎因子处于动态平衡，以保持体内状态平衡[13-15]。Jensen 等[16]报道，弓形虫株有3 个不同的谱系，Ⅰ型和Ⅲ型感染的巨噬细胞使其向M2 型极化偏移，而Ⅱ型感染的巨噬细胞则会向M1型极化偏移。有研究[2，10]结果显示，Ⅰ型和Ⅲ型弓形虫通过替代激活途径诱导巨噬细胞向M2 型方向极化，而Ⅱ型虫株诱导M1 型巨噬的极化，且Ⅰ型和Ⅲ型虫株的替代性激活通过JAK-STAT 信号通路等引发抗炎，而Ⅱ型菌株对巨噬细胞的经典激活则通过激活NF-κB 途径并引发促炎。

为研究弓形虫蛋白ROP16 与巨噬细胞之间的关系，本实验构建ROP16 过表达慢病毒载体转染至NR8383 巨噬细胞中，结果显示，ROP16过表达后向M1 型巨噬细胞偏移，其中iNOS，IL-1β 和TNF-α mRNA 水平与空白对照组和空载组相比增高，而Arg-1、IL-10 及TGF-β mRNA水平的相对表达量则降低。结合Western blot 和ELISA 实验结果，ROP16 过表达后iNOS、NF-κB、P-NF-κB、STAT1、P-STAT1 蛋白表达量增高，Arg-1 蛋白表达量降低，并且细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α 及IL-12 含量增高，抗炎因子TGF-β及IL-10 含量降低。上述研究结果说明，NR8383巨噬细胞在ROP16 蛋白作用下可能通过NF-κB信号通路向M1 型极化偏移。通过体外建立巨噬细胞可塑模型，探讨弓形虫分泌蛋白ROP16 对大鼠肺泡巨噬细胞极化的影响，旨在为M1、M2 型炎性反应及一些自身免疫性疾病治疗提供新的思路和方法，也为弓形虫ROP16 对宿主细胞的致病机制研究提供一定基础，其后应建立动物模型，进一步研究动物体内弓形虫及其效应分子对巨噬细胞极化的影响，并对弓形虫ROP16 驱动巨噬细胞向M1 型巨噬细胞偏移的作用机制做更深入研究，为相关疾病的治疗提供实验数据的支持，为后续疾病治疗提出建议。

综上所述，本研究成功构建了Ⅱ型ROP16介导的NR8383 稳定细胞系，分析了ROP16 对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 炎性反应的影响，也为弓形虫ROP16 对宿主细胞的致病机制研究提供了一定基础。