基于多元统计分析的卤煮鸡肉与鸡汤滋味差异研究

柳艳霞， 于家欢， 赵改名， 朱瑶迪， 刘世杰， 武苏苏， 常亚楠

(1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002； 2.河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002； 3.河南省肉品加工与安全国际联合实验室，河南 郑州 450002)

滋味是肉制品食用品质的重要指标。肉加热过程中生成的游离氨基酸、小肽、肌苷酸和核苷酸等呈味物质通过脱水、脱氨基或者聚合等反应形成新物质，共同组成了肉制品的滋味特征[1]。电子舌(electronic tongue)是由交互敏感传感器阵列、信号调整电路以及模式识别算法构成的模拟哺乳动物味觉系统的智能分析仪器，因其快速、简便和安全等特点得到广泛应用[2-3]。目前，电子舌系统已经用于德州扒鸡[4]和盐水鸭口感的辨识[5]、酸肉质量的区分[6]以及中华绒螯蟹滋味轮廓的评定[7]。同时，电子舌系统与不同分析方法结合，应用效果显著，不仅能分辨炖煮牛肉[8]、鲊肉粉[9]以及定量焖煮循环的风味上的差异[10]，还可以阐明炖煮次数的增加导致风味醇香的原理[11]以及蒸煮猪肉鲜味差异大但滋味相似的原因[12]。肉制品滋味受游离氨基酸、小肽和核苷酸等影响。布丽君等[13]研究发现，游离氨基酸对荣昌猪肉滋味有直接贡献。俞彦波等[14]研究表明，脂肪和蛋白质的降解、总糖和非蛋白氮的不断增加是酸肉滋味形成的主要原因。

酱卤肉制品是中国饮食文化的重要组成部分，因其风味独特深受消费者喜爱。但是，目前酱卤肉制品的加工条件较差，设备落后，生产工艺千差万别，多是作坊式生产，产品质量不稳定，无法满足市场快速发展的需求，因此实现酱卤肉制品规模化和工业化改造迫在眉睫。酱卤肉制品的核心技术是卤煮，卤煮调控是其独特风味形成的关键。目前，关于卤煮条件对肉制品品质影响的研究主要集中在风味前体物、微观结构、蛋白变性、香辛料和热处理方式等方面。王南[15]研究表明，扒鸡肉中游离氨基酸含量显著下降，老汤中游离氨基酸显著上升，高温焖煮和降温焖煮是扒鸡特征滋味形成的关键步骤。王震等[16]研究发现，卤汤反复使用过程中，鸭肉和卤汤中肌酸、氨基酸、葡萄糖含量呈现上升趋势，杂环胺也不断富集。王震[17]通过研究发现，盐水鸭和烤鸭滋味鲜美是因为其中含有较高的鲜味和甜味氨基酸、小肽以及风味核苷酸。程天赋等[18]研究表明，85 ℃是白煮鸡胸肉卤制的最适温度。王春青等[19]通过分析得出，清远鸡、白羽肉鸡和童子鸡最适宜蒸煮加工。孟祥忍等[20]在卤煮过程中发现，牛肉嫩度在卤煮3 h后得到改善。本课题组前期研究发现，90～95 ℃是卤煮鸡腿质构、色泽变化的关键温度[21]。当卤煮温度为85 ℃、煮制时间为2.5 h时，酱卤肉制品感官评分达最大，产品风味最佳[22]。但是，利用电子舌开展卤煮条件对酱卤肉制品滋味影响的研究却未见报道。多元统计分析是对多个变量之间相互关系的研究。本研究选取鸡腿肉为原料，通过多元统计分析探究不同卤煮条件下卤鸡肉和鸡汤的滋味变化，即采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和聚类分析(cluster analysis，CA)确定鸡肉与鸡汤滋味品质整体结构，并应用灰色关联分析明确鸡肉与鸡汤滋味与游离氨基酸的相关性，以期为酱卤肉制品的滋味评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料及试剂 鸡腿购自河南大用实业有限公司，质量为每只鸡腿(250±20) g，品种为罗斯308肉鸡(42日龄)；肉桂、良姜、白芷、陈皮和草果等香辛料及食盐购自郑州丹尼斯大卖场(丰产店)。正己烷、乙腈、液相检测衍生试剂(A、B)以及天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和赖氨酸(Lys)共17种氨基酸标准品购自月旭科技(上海)股份有限公司，色谱纯。

1.1.2 主要仪器及设备 AsrreeII/LS16型电子舌(法国Alpha Mos公司)；ALLEGRA-64A型台式冷冻离心机(南京欧捷仪器设备有限公司)；电子可调电炉(上海树立仪器仪表有限公司，单联功率2 kW)；Waters-515型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；DW-YL270型超低温冷冻储存箱(中科美菱低温科技有限责任公司)；THZ-82型恒温水浴锅(江苏金坛市杰瑞尔电器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 用含香辛料和食盐的水卤煮鸡腿(100 kg鸡腿添加肉桂、良姜和白芷各180 g，陈皮、草果各60 g，砂仁、豆蔻各 30 g，丁香6 g，食盐2.5 kg)，设置高温(95 ℃)和低温(85 ℃)2个温度，分别维持30、60、90和120 min后冷却至25 ℃，测定前样品于-40 ℃保存。其中，编号A～D分别代表低温(85 ℃)卤煮鸡肉、高温(95 ℃)卤煮鸡肉、低温(85 ℃)卤煮鸡汤和高温(95 ℃)卤煮鸡汤；编号1～4分别代表卤煮时间30、60、90和120 min。

1.2.2 电子舌测定 鸡肉：去除鸡皮后切粒，取15 g置于250 mL烧杯内，加150 mL超纯水，50 ℃水浴浸泡20 min后取上清液4 ℃、5 000 r·min-1离心15 min后过滤，收集滤液待测；鸡汤：将鸡汤在与鸡肉同样条件下离心过滤，收集滤液待测。电子舌检测参数：选用法国Alpha MOS公司的5#传感器，给出酸(SRS传感器)、甜(SWS传感器)、苦(BRS传感器)、咸(STS传感器)、鲜(UMS传感器)以及复合1(GPS传感器)、复合2(SPS传感器)的相对强度值。7根传感器均为交叉互感型传感器，5个滋味特征明确的传感器是对该种味道更为敏感，2个复合型传感器是对多种滋味同时有响应，对单一滋味没有明显响应。传感器采集数据1 s·个-1，采集时间120 s，每个样品做7个平行。

1.2.3 游离氨基酸测定 将恒温水浴锅预热至(50±1)℃；分别将液相检测衍生试剂A、B溶液稀释至原浓度的1/5。量取氨基酸标准品0.4 mL置于试管中，加入稀释的A、B溶液各0.2 mL摇匀。在(50±1)℃水浴加热45 min取出，加入正己烷溶液0.4 mL振摇；用孔径0.45 μm有机膜过滤，放置30 min后取澄清下层液。样品的衍生步骤与标准品相同。色谱柱，Ultimate®amino acid 色谱柱；柱温，40 ℃；紫外检测波长，254 nm；进样量，5 μL；流动相A，V(0.1 mol·L-1醋酸钠，pH=6.5)∶V(乙腈)=93∶7；流动相B，V(超纯水)∶V(乙腈)=20∶80；洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.4 数据处理 采用SPSS 16.0对电子舌数据作方差分析、主成分分析和聚类分析[23-24]；应用SPSS软件对游离氨基酸数据做方差分析；参照吴慧琳等[25]的方法，采用灰色关联分析电子舌数据与游离氨基酸数据的关系。

2 结果与分析

2.1 卤煮鸡肉与鸡汤滋味的电子舌分析

电子舌传感器对鸡肉和鸡汤样品滋味的响应强度见表2。鸡肉和鸡汤样品的电子舌传感器响应值的标准差均低于10%，重复性良好，说明卤煮过程具有相对一致性。各传感器对相同样品的响应值不同，STS(咸)传感器响应强度最大，SWS(甜)传感器响应强度最小。低温(85 ℃)和高温(95 ℃)卤煮的鸡肉和鸡汤样品电子舌传感器的响应值均差异显著(P<0.05)，但低温卤煮鸡汤的STS(咸)和BRS(苦)传感器差异较小(P>0.05)。随着卤煮时间延长，高温(95 ℃)卤煮鸡肉的所有响应值均增加(P<0.05)；而低温卤煮鸡肉的SRS(酸)、UMS(鲜)、GPS(复合1)、SPS(复合2)和BRS(苦)传感器响应值却降低(P<0.05)；无论卤煮温度高低，随着卤煮时间的延长，鸡肉的STS(咸)传感器响应值增加(P<0.05)。在传感器响应值大小方面，STS(咸)响应值最大、UMS(鲜)响应值次之；其他传感器响应值差别不大(P>0.05)。在相同卤煮温度条件下，不同时间鸡肉和鸡汤样品电子舌响应值重叠度良好，STS(咸)和UMS(鲜)传感器的响应数值分布离散度较大，其他传感器的响应数值离散度接近，这表明电子舌传感器对鸡肉与鸡汤滋味有较好的区分效果。

表2 不同卤煮条件鸡肉和鸡汤的电子舌响应值

主成分分析法将数据降维并通过PCA图上的距离表征不同样品类间的差异[26]。不同卤煮处理鸡肉与鸡汤的电子舌滋味品质主成分分布情况见表3。卤煮处理鸡肉与鸡汤滋味品质主要集中在前2个主成分，总方差贡献率为99.987%。主成分1(PC1)的方差贡献率99.837%，主要包括咸味、鲜味等信息；主成分2(PC2)的方差贡献率为0.149%，主要包括苦味、甜味信息。以PC1和PC2为指标绘制主成分因子载荷图。由图1可知，PC1主要由鸡肉与鸡汤的特征性滋味(咸味、鲜味)指标组成，PC2主要由非特征性滋味(苦味、甜味)指标组成。根据电子舌对鸡肉和鸡汤不同传感器的响应值采用PCA将16个样品进行区分。PCA图上16个样品有明显的区分，PC1和PC2的累积贡献率为96.30%，可以反映样品的综合信息。样品A1～A4是低温卤煮的鸡肉样品，均聚集在第二、三象限，而其他样品聚集在第一、四象限。不同样品间差异显著，这表明电子舌可以进行有效区分。高温卤煮与低温卤煮的鸡肉样品滋味主要根据PC1区分，间距较远，滋味差异较大；而鸡汤样品滋味主要根据PC2区分，距离接近，滋味差异较小。

图1 鸡肉与鸡汤经不同卤煮处理后滋味品质的主成分分析

表3 鸡肉与鸡汤电子舌滋味的主成分分布

聚类分析法是根据物以类聚原则实现数据分类，以认知其中存在的内部联系[27]。以欧氏距离为聚类距离，采用最短距离法对样品的电子舌传感器响应值进行聚类分析，如图2所示。16种样品分为2大类，第一类为高温卤煮鸡肉与所有鸡汤样品(C1～C4、D1～D4、B1～B4)，第二类为低温卤煮鸡肉样品(A1～A4)，与主成分分析结果完全一致。低温卤煮鸡肉样品中，A3与A4的鸡肉滋味更接近，也与主成分分析的结果基本一致。根据图2的聚类分析结果，对聚为一类的样品电子舌的滋味响应值进行差异分析。由表4可知，不同类别样品的电子舌滋味品质均存在差异(P<0.05)，第一类样品的STS(咸)、UMS(鲜)、SWS(甜)、SRS(酸)、BRS(苦)及GPS(复合1)传感器的响应值均低于第二类低温卤煮鸡肉(P<0.05)，第二类低温卤煮鸡肉的SPS(复合2)传感器响应值低于第一类(P<0.05)。

图2 不同卤煮处理鸡肉与鸡汤滋味品质的聚类分析

表4 不同卤煮处理鸡肉与鸡汤滋味品质的差异性分析

2.2 卤煮鸡肉与鸡汤游离氨基酸的差异分析

不同卤煮条件鸡肉与鸡汤的游离氨基酸结果见表5和表6。无论高温还是低温卤煮，鸡肉的游离氨基酸含量先升高后降低，85 ℃平均含量3.360～3.943 mg·g-1(P<0.05)，95 ℃则在4.058～4.416 mg·g-1间波动(P>0.05)；鸡汤游离氨基酸含量逐渐增加，85 ℃时从8.581增至21.445 mg·g-1(P<0.05)，95℃从18.207增至29.584 mg·g-1(P<0.05)。随着时间的延长和温度的升高，鸡肉中蛋白质受热降解，产物游离氨基酸含量增加，分别在90 min(85 ℃)和60 min(95 ℃)时达最大。部分水溶性氨基酸流入汤中，鸡汤总游离氨基酸含量上升，120 min时达最大。卤煮120 min的鸡肉样品中Arg含量最高，为0.920 mg·g-1，占其总游离氨基酸含量的26.84%；其次为Ala和Cys，含量分别0.534和0.465 mg·g-1，占其总游离氨基酸含量的15.57%和13.55%。呈味氨基酸中的Ala含量最高，均高于0.500 mg·g-1。Ala是典型的甜味氨基酸。由于其余呈甜味的氨基酸含量均在0.100 mg·g-1左右，因此鸡肉中Ala为甜味的主要贡献者。5种呈甜味游离氨基酸随卤煮时间的延长而增加(P<0.05)。呈鲜味的Glu含量相对较高，不同时间的含量存在差异(P<0.05)，推测是Glu降解量和溶于汤汁中的量不同导致。鸡肉与鸡汤中呈鲜味的Asp和Glu随着卤煮时间的延长都显著上升(P<0.05)。综上，卤煮后的鸡肉与鸡汤会有较明显的甜鲜味。鸡肉与肉汤的鲜美滋味并不是由单一氨基酸决定的，鲜味、甜味和苦味氨基酸间的平衡及相互影响可能是决定鸡肉与肉汤滋味的关键因素。

表5 不同卤煮条件鸡肉的游离氨基酸种类及含量

表6 不同卤煮条件鸡汤的游离氨基酸种类及含量

2.3 鸡肉和鸡汤电子舌响应值与氨基酸含量的灰色关联度

2.3.1 样品的传感器相对响应值及无量纲化处理 参照灰色关联分析理论，计算出8种样品不同电子舌传感器相对响应值，结果如表7和表8所示。将谷氨酸含量数值设为参考数列，比较数列为17个氨基酸响应值，将母序列与子序列进行灰色关联度分析。

表7 鸡肉中氨基酸含量的相对响应值

表8 鸡汤中氨基酸含量的相对响应值

2.3.2 氨基酸与鲜味和咸味的关联系数及关联度计算 计算8种鸡肉产品的鲜味和咸味参考数列与比较数列(电子舌传感器的响应值)的绝对差值。根据参照吴慧琳等[25]的方法，将绝对差值分别进行计算得到氨基酸响应值与鲜味和咸味的关联系数，再将灰色关联系数带入公式得到氨基酸响应值与鸡肉鲜味和咸味的关联度。X1～X17分别为Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe和Lys。由图3和图4可知，有8种和7种氨基酸分别与鸡肉鲜味和咸味关联度均在0.70以上，表明氨基酸与鸡肉鲜味和咸味间存在较高的关联性。Glu、Asp、Thr、Ala和Ile对鲜味的贡献大，而咸味则与Glu、Thr、Ala、Asp和Gly关联度高。同理，各有13种氨基酸与鸡汤鲜味和咸味的关联度均在0.70以上，Glu、Ser、Gly、Cys和Met对鸡汤鲜味和咸味的贡献均较大。

注：A为鸡肉氨基酸含量与鲜味；B为鸡肉氨基酸含量与咸味；C为鸡汤氨基酸含量与鲜味；D为鸡汤氨基酸含量与咸味。X1～X17为Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe和Lys。下同。

图4 卤煮鸡肉与鸡汤氨基酸与鲜味和咸味的关联度

2.3.3 鲜味和咸味与氨基酸的回归模型 从氨基酸与鲜味和咸味的灰色关联度结果可得，不同氨基酸对鲜味和咸味的影响能力不同。建立氨基酸分别与鲜味和咸味的关系，分别以咸味和鲜味响应值与X1～X17共17种氨基酸进行回归分析，Y为鸡肉与鸡汤鲜味和咸味响应值。鸡肉鲜味与氨基酸灰色关联系数的回归方程为：Y=2 011.060-4.582X1+2.471X2+5.579X7+5.807X8-16.809X13；鸡肉咸味的回归方程为：Y=3 748.614-34.783X1-11.638X2+50.766X4-3.366X7-3.264X8。2个回归方程均通过F检验和t检验，决定系数R2分别为0.865 3及0.855 0。鸡汤鲜味与氨基酸灰色关联系数的回归方程为：Y=2 349.010-0.016X2+0.220X3+0.304X4-0.107X10-1.349X12；鸡汤咸味的回归方程为：Y=4 452.640-0.762X2+0.006X3+2.456X4-0.615X10+0.404X12。2个回归方程均通过F检验和t检验，决定系数R2分别为0.958 0及0.793 0，无论是鸡肉还是鸡汤，鲜味与氨基酸、咸味与氨基酸间的回归方程具有较高的拟合度。该结果表明，评价卤煮鸡肉的鲜味和咸味时可采用Asp、Glu、Thr和Ala等分析，评价鸡汤鲜味和咸味时可采用Glu、Ser、Gly、Cys和Met等。同时，鲜味和咸味与氨基酸的回归模型也表明，鸡肉与鸡汤的滋味品质存在差异。

3 结论与讨论

为阐释卤煮鸡肉与鸡汤的滋味差异，本研究应用电子舌和高效液相色谱仪，综合运用主成分分析、聚类分析及灰色关联分析方法对卤煮鸡肉与鸡汤滋味和游离氨基酸的变化进行多元统计分析。结果表明，2种卤煮温度鸡肉和鸡汤的电子舌滋味强度大部分发生显著变化(P<0.05)，但85 ℃鸡汤的咸味和苦味除外；聚类分析与主成分分析结果都将样品分为2类；电子舌对卤煮鸡肉与鸡汤滋味有较好的区分效果。鸡肉蛋白质受热降解，游离氨基酸含量先升高后降低，部分氨基酸转移至汤中，鸡汤中游离氨基酸含量逐渐增加，赋予鸡汤更好的滋味；特定氨基酸对鸡肉与鸡汤鲜味和咸味的电子舌响应值均影响显著(P<0.05)。游离氨基酸与卤煮鸡肉和鸡汤的鲜味和咸味高度相关，因此构建鲜味和咸味与氨基酸灰色关联系数的回归方程并通过检验，表明采用特定氨基酸评价鸡肉与鸡汤的鲜味和咸味是可行的。游离氨基酸是蛋白质的降解产物之一，对肉制品滋味形成起重要作用。高温(95 ℃)卤煮鸡肉的各项滋味指标均随时间延长增加(P<0.05)，而低温(85 ℃)则是咸味和甜味增加(P<0.05)，酸味和鲜味降低(P<0.05)，苦味无变化(P>0.05)。卤煮鸡肉的游离氨基酸含量先升高后降低(P<0.05)，随时间延长和温度的升高，在90 min(85 ℃)和60 min(95 ℃)时达最大。卤煮鸡肉呈现的滋味仍然是肉本身的特征滋味，经过长时间卤煮鸡肉的滋味会逐渐同短时间卤煮的滋味成分相近[24]。卤煮温度较高时，肌肉纤维细胞破裂严重，蛋白变性及分解速率加快，嘌呤碱基及部分苦味肽含量会升高，影响整体滋味，这表明合适的卤煮温度和时间会提高酱卤肉制品的滋味品质。评价卤煮鸡肉的鲜味和咸味时可采用Asp、Glu、Thr、Ala等，这与Ala、Gly和Met是影响蟹肉滋味的重要的氨基酸类型[28]不一致，说明物种不同对滋味的影响较大。蒸制有利于鸡肉中蛋白质降解产生较多的滋味物质，赋予产品更好的滋味[29-30]。

灰色关联分析是通过灰色因素即不确定因素来决定主次因素及其关联度的评价方法[31]。目前肉制品滋味方面的研究主要集中在不同肉制品的滋味检测，而针对肉制品滋味差异的原因分析较少。电子舌滋味数据与游离氨基酸之间缺乏关联性，酱卤肉制品滋味评价缺少统一的标准。本研究采用灰色关联分析建立卤煮鸡肉与鸡汤滋味与游离氨基酸的关联，根据关联度判断影响鸡肉与鸡汤滋味的主要游离氨基酸，明确卤煮鸡肉与鸡汤滋味品质的差异，实现采用特定氨基酸评价鸡肉与鸡汤的鲜味和咸味，从而为酱卤肉制品的滋味评价提供参考。