葡萄YUCCA家族基因的鉴定及在穗梗褪绿过程中的表达分析

李志谦， 邹东方， 李靖雯， 叶霞， 冯建灿

(河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002)

生长素是植物生长重要的激素之一，参与植物生长发育、衰老、向地性和逆境胁迫等多个生物学过程[1-5]。IAA(吲哚乙酸，3-Indoleacetic acid)是植物中的主要生长激素，主要通过色氨酸依赖途径和非色氨酸依赖途径合成。遗传研究表明，YUCCA(黄素单加氧酶)可以催化IPA(吲哚-3-丙酮酸，indole-3 pyruvate)生成IAA，是色氨酸依赖合成途径中的限速酶，对生长素的合成起着重要的作用[2, 6-8]。

YUCCA是一个多基因家族，目前已在20多种植物中被鉴定得到[1, 9-12]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、杨树(Populustrichocarpa)、水稻(Oryzasativa)、草莓(Fragariavesca)和玉米(Zeamays)等物种中的分析表明，YUCCA基因家族包括6个保守的结构域，FAD-binding site(黄素嘌呤二核苷酸结合位点)和 NAPDH-binding site(还原型辅酶Ⅱ结合位点)具有典型的GxGxxG序列，对YUCCA酶活性至关重要，FAD-binding site位于N端，NAPDH-binding site位于基因的中间位置。GC-motif(ExxxxxGG)(GC基序)紧邻FAD-binding site，可以稳定FAD-binding site，ATG-containing motif 1 (DxxxxATG)(ATG基序1)可以连接FAD-binding site和 NAPDH-binding site[13]。FMO-identify sequence motif (FxGxxxHxxxY)(黄酶素单加氧酶识别基序)在NADPH-binding domain的上游且有助于NADPH的结合[10, 14]。ATG-containing motif 2(ATG基序2)通常位于序列的C端，在A的前方有保守的F，在G的后方有保守的Y[13]。拟南芥、水稻和玉米等植物中的研究结果显示，YUCCA基因参与植物生长发育的多个生物学过程，例如在胚胎、维管束、花、果实、根的发育过程和叶片衰老中都发挥着重要作用[2, 6, 15]。

葡萄采摘后，在贮藏过程中，易发生穗梗褪绿现象，严重影响葡萄的外观品质和商品价值。生长素及其合成关键基因YUCCA是否参与穗梗褪绿过程还未见报道。本研究对葡萄中的YUCCA家族基因进行了鉴定，利用生物信息学手段分析了其家族成员的内含子/外显子结构和保守结构域，分析了葡萄YUCCA家族基因启动子顺式元件，并检测了阳光玫瑰葡萄采后贮藏过程中穗梗中生长素含量的变化及YUCCA家族基因的表达趋势，研究结果将为进一步分析葡萄YUCCA家族基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 葡萄YUCCA家族基因的全基因组鉴定

从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载葡萄12X版本全基因组蛋白序列。利用拟南芥YUCCA蛋白序列在葡萄基因组网站中进行筛选搜索。筛选得到的候选基因，使用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线服务对所有假定序列进行结构域验证。鉴定后的基因根据其在染色体上的位置进行命名。

1.2 葡萄YUCCA家族基因的特征和保守基序分析及系统进化树构建

从葡萄基因组网站中(http://www.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)获取YUCCA家族基因的外显子和内含子的结构信息，然后采用在线软件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制图形；蛋白序列提交MEME(http://meme-suite.org/)，设置输出值为 5，分析蛋白保守基序；从NCBI数据库下载获得拟南芥和水稻的YUCCA家族基因序列，通过MEGA6软件构建系统进化树，采用邻接法(neighbor-joining)和最短演化长度算法(minimal evolution)，bootstrap test设置为1 000。利用Clustal X软件进行多重序列比对，然后通过GeneDoc软件对比对结果作图。

1.3 葡萄YUCCA家族基因顺式作用元件与表达分析

通过在葡萄基因组网站中(http://www.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)搜索，获得VvYUCCAs家族基因ATG上游2 000 bp的启动子序列，然后提交PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站，分析启动子上的顺式作用元件；在阳光玫瑰葡萄(VitislabruscanaBaily×V.viniferaL.)成熟期采收果实，用1-MCP贴剂处理，以未处理的果穗作为对照，于16 ℃、相对湿度95%的条件下贮藏，处理后0、3、7、14、21 和28 d分别采集穗梗，提取RNA，反转录合成cDNA，利用实时荧光定量PCR技术检测YUCCA基因在穗梗中的表达情况，定量引物见表1；IAA提取方法参照文献[16]，并利用LC-MS方法[17]，检测穗梗中内源IAA的含量。

2 结果与分析

2.1 葡萄YUCCA家族基因的鉴定

通过在葡萄全基因组查找，鉴定得到10个YUCCA基因，分布在第4、5、7、11和18染色体上，按这些基因在染色体上的位置进行命名VvYUCCA1-VvYUCCA10(表1)。葡萄YUCCA家族基因开放阅读框大小为1 134～1 569 bp，编码377～522个氨基酸。多重序列比对结果显示，FAD-binding site和GC-motif，在基因序列的N端，NAPDH-binding site结构域位于序列中间位置(图1)，FMO-identi-fying sequence结构域位于NAPDH-binding site结构域上游，ATG-containing motif 2位于序列的C端，序列比对结果与已报道结果一致[1,18]。

表1 葡萄YUCCA家族基因的基本信息

黑色表示相似度为100%，灰色表示相似度为75%。

2.2 葡萄YUCCA家族基因结构和进化关系分析

为了阐明葡萄YUCCA家族基因与其他物种之间的进化关系，本研究将葡萄、拟南芥和水稻的YUCCA家族基因构建进化树分析(图2)。与拟南芥相似，葡萄YUCCA家族基因可以分为4个亚家族，A亚家族包括YUCCA1、8和3，B亚家族成员最少，只有YUCCA2，C亚家族包括YUCCA4和7，D亚家族成员最多，包括YUCCA5、6、9和10(图2)。

葡萄、拟南芥和水稻中的YUCCA基因分别以绿色、红色和蓝色表示。

为了进一步研究葡萄YUCCA家族基因在结构上的进化关系，本研究对葡萄中的10个YUCCA基因结构外显子/内含子结构进行了分析。结果显示，葡萄YUCCA家族基因的结构相对简单，A、B和D亚家族基因结构相似，都具有4个外显子和3个内含子，而C亚家族的2基因则差别较大，YUCCA7和4分别有3个和5个外显子(图4-B)。

图3 葡萄YUCCA家族基因的外显子/内含子结构分析

2.3 葡萄YUCCA家族基因的顺式作用元件分析

激素和外部环境条件都会对基因的表达产生重要的影响，进而影响植物的生长发育。在葡萄基因组网站上查找YUCCA家族基因ATG上游2 000 bp的启动子序列，通过在线软件PlantCare进行了顺式元件预测(表2)。在YUCCA家族基因的启动子中有ABA响应元件(ABRE)、SA响应元件(TCA)、茉莉酸响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、生长素响应元件(TGA-element)及逆境响应元件，如低温响应元件LTR和MBS等。结果表明，葡萄YUCCA家族基因的表达与激素和环境条件密切相关。

表2 葡萄YUCCA家族基因启动子顺式元件分析

2.4 贮藏时间对葡萄穗梗褪绿的影响

穗梗褪绿是鲜食葡萄采后面临的重要问题，严重影响果穗的外观品质和商品价值。1-MCP(1-甲基环丙烯，1-methylcyclopropene)是果蔬采后保鲜中常用的保鲜剂。本研究采摘了阳光玫瑰葡萄成熟期的果实，用1-MCP进行处理。结果显示，阳光玫瑰葡萄采后贮藏7 d时，部分穗梗开始出现褪绿，贮藏14 d时，大部分穗梗已经褪绿，21和28 d，穗梗完全褪绿(图4)。

图4 阳光玫瑰葡萄采后穗梗褪绿过程

2.5 葡萄穗梗褪绿过程中IAA含量的变化

激素之间的拮抗和协同作用在植物的生长发育过程中发挥着重要的调节作用。为了探究乙烯和内源激素生长素对穗梗褪绿的影响，本研究采用阳光玫瑰葡萄为研究材料，用采摘后0、7、14、21和28 d的样品，进行内源IAA含量测定。结果显示，阳光玫瑰葡萄采后，IAA含量随着贮藏时间的延长明显升高，呈先升高、然后降低，随后又明显升高的趋势(图5)。

图5 阳光玫瑰葡萄穗梗褪绿过程中内源激素IAA含量的变化

2.6 葡萄YUCCA家族基因在穗梗褪绿过程中的表达分析

穗梗褪绿是葡萄采后贮藏过程中面临的重要问题，与葡萄果粒不同，穗梗乙烯释放量较高[19]，YUCCA家族基因可以作为节点基因调控乙烯生成。阳光玫瑰葡萄采后0～28 d，穗梗明显褪绿，同时伴随乙烯含量的升高。为了探究YUCCA家族基因是否参与穗梗的褪绿过程，本研究分析了YUCCA家族基因在阳光玫瑰葡萄采后穗梗中的表达趋势。结果显示，YUCCA1和YUCCA8与IAA含量呈正相关关系，表明这2个基因可能调控穗梗褪绿过程中的IAA合成，在穗梗褪绿过程中发挥重要作用(图6)。

图6 YUCCA家族基因在阳光玫瑰葡萄穗梗褪绿过程中的表达

3 结论与讨论

生长素在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用，YUCCA基因是IAA合成过程中的关键基因[2, 9]。截至目前，植物已报道的YUCCA家族基因除了矮牵牛只有1个成员外[20]，其他的都是多个成员，例如拟南芥中有11个、菘蓝中有13个[18]、苹果中有20个[1]、大豆中有22个[10]。越来越多的YUCCA基因在不同物种中被发现。本研究中，在葡萄基因组中鉴定到10个具有YUCCA家族基因保守结构域的基因，命名为YUCCA1～YUCCA10，不均匀的分布在葡萄的5条染色体上。在6个结构域中，FAD-binding motifs序列在葡萄的10个YUCCA基因中完全一致，表明这2个基序在植物进化过程中高度保守。与拟南芥和水稻中的基因进行聚类分析，结果显示这些基因可以分为4个亚家族，同一个亚家族的基因含有相似的蛋白基序。与苹果和玉米中报道的结果一致[1, 11]。外显子/内含子结构包括外显子的数量、位置及内含子的长度在不同的物种或同一物种不同品种之间可能都存在区别，拟南芥中YUCCA1和YUCCA2有4个外显子和3个内含子，而YUCCA5没有内含子[21]；葡萄中同一亚家族YUCCA基因成员间有相似的外显子内含子结构及保守结构域，表明这些基因可能存在相似功能，而不同的蛋白基序和内含子/外显子结构可能赋予了不同基因特殊的功能。

YUCCA家族基因功能研究在拟南芥、水稻和大豆等植物中已经有大量报道[2, 3, 12, 22-23]。在拟南芥和水稻中，过表达YUCCA家族基因导致IAA含量明显升高[22, 24]，通过YUCCA路径合成的IAA对胚胎的发育过程中极性的建立至关重要[3]。拟南芥AtYUCCA6过表达后叶片衰老延迟[25]；桃PpYUC11在IAA合成和果实成熟中发挥着重要的作用[26]，与果实硬度密切相关[27]；草莓中YUCCA1过表达导致果实成熟期延迟，果实中内源IAA、叶绿素含量和果实硬度较高[28]；菘蓝IiYUCCA6基因在烟草中过表达后IAA含量明显升高，且可以延缓植株衰老[18]。这些研究表明，YUCCA家族基因参与植物生长发育的多个生物学过程，且在IAA合成过程中的功能比较保守。

对葡萄穗梗褪绿过程中IAA的含量进行检测，发现随着穗梗褪绿加重，IAA的含量明显升高。表明IAA可能参与穗梗的褪绿过程。YUCCA是IAA合成的关键调控基因，在穗梗褪绿过程中，VvYUCCA1和VvYUCCA8与IAA含量呈正相关关系。推测这2个基因是穗梗中调控IAA合成的关键基因。但是，穗梗褪绿涉及多种因素的参与，例如乙烯和叶绿素降解等[19-29]，IAA是否参与穗梗褪绿过程，VvYUCCA1和VvYUCCA8是否是穗梗褪绿过程中控制IAA的合成的关键基因，与其他因素之间是否存在相互作用有待进一步研究。