乳酸菌混合发酵毛酸浆果汁工艺优化及发酵特性分析

王柳岑，朱永乐，鞠葛金悦，刘至立，李美莹，王晶晶

（锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121000）

毛酸浆（Physalis pubescens L.）为茄科酸浆属一年生草本植物，其果实颜色金黄，外形圆润，俗称黄菇娘，味道酸甜可口，是我国东北地区一种营养丰富的应季水果。研究表明，毛酸浆富含黄酮、多酚等多种功能性成分，具有抗炎、提高免疫力等多种功效[1-3]，是一种极具开发潜力的浆果。目前市场上毛酸浆的深加工产品少，主要是果汁、罐头、果酱和果脯等初级加工产品[4-8]。大量研究表明，乳酸菌发酵可以改善果蔬汁的品质、风味和抗氧化活性[9-12]。另外，乳酸菌具有调节肠道pH 值、保护肠道、抑制肿瘤和预防腹泻等生理功效，因此乳酸菌发酵果蔬汁的研制成为近年来的研究热点[13-16]。国内学者分别采用植物乳杆菌、短杆乳杆菌、副干酪乳杆菌等对葡萄汁、猕猴桃果汁、树莓汁和拐枣汁等进行了单一菌种或者复合菌种的发酵工艺研究，均取得了较好的效果[16-20]。本团队前期研究表明，植物乳杆菌发酵毛酸浆果汁经体外消化后，乳酸菌仍具有很好的活力，果汁中多酚含量和抗氧化活性均较高[21]。有学者分别比较了植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等常见益生菌在毛酸浆中的单株发酵特性，对乳酸菌复合酵母菌发酵工艺进行了研究，但未对植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的复合发酵工艺进行研究，其发酵后抗氧化成分及主要气味变化也尚未明确[22-24]。

本研究通过单因素和响应面试验设计，对植物乳杆菌和副干酪乳杆菌混合发酵毛酸浆果汁的工艺配方进行了优化，对发酵前后果汁理化指标、抗氧化成分（黄酮和多酚）以及气味进行了检测，为乳酸菌发酵毛酸浆果汁类产品的开发提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

毛酸浆，购于辽宁省锦州市；植物乳杆菌1.1856（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳杆1.9089（Lactobacillus paracei），锦州医科大学实验室保存。

亚硝酸钠、福林酚、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯；没食子酸（标准品，纯度≥98%）、芦丁（标准品，纯度≥98%），购于索莱宝生物科技有限公司；MRS 液体培养基，购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.2 仪器与设备

RBM-615 型榨汁机，德国瑞本公司；UV-1800 型分光光度计，日本岛津公司；PHS-3C 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；LRH-250 型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；HH-4D 型恒温水浴锅，上海比朗仪器制造有限公司；WTY-A 型手持糖度仪，成都豪创光电仪器有限公司；PEN3 型电子鼻，德 国Airsense Analytics Gmbh 公 司；ZHJH-112 型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；HR/T20MM 型立式冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；FA2004N 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毛酸浆果汁的制备

挑选新鲜无坏果的毛酸浆果实，清洗去宿萼后榨汁，一层滤布过滤，82 ℃灭菌15 min。

1.2.2 毛酸浆果汁发酵

取出保存在甘油管中的乳酸菌，接种于MRS 液体培养基中，置于37 ℃培养箱静置培养12 h，活化2代。将不同菌种比例的菌液配比后，以107CFU/mL的菌密度接入毛酸浆果汁中，于封口玻璃瓶中培养，37 ℃静置发酵24 h，每6 h 取样进行综合评价。

1.2.3 综合评价

1.2.3.1 感官评价

参考仵白敏[17]的方法，随机挑选受过相关训练的10 人，采取随机抽样的方式，分别对发酵果汁的色泽、组织状态、气味、口感、酸甜度5 个项目进行感官评价，评分标准如表1 所示。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory evaluation scoring criteria

1.2.3.2 抗氧化性评价

由于毛酸浆富含具有抗氧化性的黄酮、多酚等功能性成分，因此对黄酮和多酚的含量进行了检测，评分标准如表2 所示。

表2 抗氧化性成分评分标准Table 2 Antioxidant composition scoring criteria

1.2.3.3 综合评分的确定

将黄酮含量、多酚含量和感官品质3 项指标拟合而成综合评分。综合评分权重的确定是采用专家评分的方法，即请专家对3 个指标（总和为100 分）的重要度进行评分，确定3 项指标的权重系数分，具体如表3 所示[25]。

表3 指标的专家权重评分结果Table 3 Weight scoring results of indicators by experts

综合评分=0.50×感官评分+0.25×总黄酮含量评分+0.25×多酚含量评分

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 复合菌种接种比例试验

在接种量1%（V/V），发酵时间12 h 条件，调整植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的接种比例（后文简称菌种比）分别为0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0（V/V）（配比后菌密度107CFU/mL），对制备的乳酸菌混合发酵毛酸浆果汁进行综合评价。

1.2.4.2 复合菌种接种量试验

在菌种比例2∶1（V/V），发酵时间12 h 条件下，调整菌种接种量分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（V/V），对制备的乳酸菌混合发酵毛酸浆果汁进行综合评价。

1.2.4.3 复合菌种发酵时间试验

在菌种比例2∶1（V/V），接种量1%（V/V）条件下，调整发酵时间分别为0、6、12、18、24 h，对制备的乳酸菌混合发酵毛酸浆果汁进行综合评价。

1.2.5 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，进一步采用Box-Behnken Design（BBD）试验设计对3 个发酵因素进行优化，试验设计见表4。

表4 响应面试验因素水平表Table 4 Factor and level of response surface test

1.2.6 测定项目与方法

1.2.6.1 乳酸菌活菌数

根据GB 4789.35—2016[26]进行乳酸菌计数。

1.2.6.2 发酵指标

pH 值：使用pH 计测定；总酸含量：参照GB/T 12456—2021[27]中的方法测定，总酸度以乳酸计算；可溶性固形物含量：使用手持糖度仪测定；总糖含量：采用DNS 比色法[28]测定，标准曲线为：y=0.639 9x-0.074 6，R2=0.997 9。

1.2.6.3 总黄酮和多酚含量

总黄酮含量：参考雷静文等[29]的方法测定；多酚含量：采用Folin-Ciocalteu 检测法[30]测定。

1.2.6.4 电子鼻检测

参考韩雪等[31]的方法，对样品进行电子鼻检测，仪器参数：载气流速100 mL/min，清洗时间100 s，检测时间60 s，样品准备时间5 s，自动调零时间5 s，选择58 s 时的响应值用于数据分析。对新鲜果汁、灭菌后的新鲜果汁、发酵果汁和灭菌后的发酵果汁4 个样品进行检测，灭菌方法采用巴氏灭菌法。

1.2.7 数据处理

数据均以xˉ±s 表示，采用Excel 2010 和SPSS 26.0进行统计分析，采用Origin2018-64 绘制图。响应面试验设计采用Design Expert 10 软件，挥发性气味成分采用WinMuster 软件分别进行PCA、Loading 和LDA 分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

如图1～3 所示，菌种比、接种量和发酵时间均对毛酸浆果汁的综合评分有很大影响，菌种比为2∶1时，发酵果汁的综合评分最高，为（25.8±0.48）分（图1）；随着接种量和发酵时间的增加，发酵果汁的综合评分呈先上升后下降的趋势，当接种量和发酵时间分别超过1.0%和12 h 时，由于发酵果汁过酸使感官评分下降，导致综合评分下降（图2～3）。因此，选取菌种比2∶1，接种量1.0%和发酵时间12 h 为响应面优化试验中的0 水平。

图1 复合菌种接种比例对毛酸浆果汁综合评分的影响Fig.1 Effect of inoculation ratio of mixed starins on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

图2 复合菌种接种量对毛酸浆果汁综合评分的影响Fig.2 Effect of inoculation concentration of mixed starins on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

图3 复合菌种发酵时间对毛酸浆果汁综合评分的影响Fig.3 Effect of fermentation time of mixed strains on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面优化发酵工艺试验

根据单因素试验的结果，以菌种比（A）、接种量（B）和发酵时间（C）为自变量，响应面试验设计和结果见表5，方差分析见表6。

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Response surface test design and results

表6 回归模型的方差分析Table 6 ANOVA for the regression models

对表5 中的试验数据经多元回归分析，得到发酵毛酸浆果汁综合评分（Y）对菌种比（A）、接种量（B）和发酵时间（C）的回归方程为：

Y=26.01+0.49A+0.96B+0.34C-1.26AB-0.82AC-1.52BC-1.69A2-1.21B2-1.60C2

由表6 的方差分析结果可知，该试验模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著，决定系数（R2）为0.971 8，调整决定系数（R2adj）为0.935 6，说明该回归方程具有良好的拟合度和可信度[32]，因此该回归方程可用于毛酸浆果汁发酵结果的理论推测。其中，A、AC 对发酵毛酸浆果汁综合评分的影响显著（P＜0.05），B、AB、BC、A2、B2、C2的影响极显著（P＜0.01）。影响发酵毛酸浆果汁综合评分各因素的主次顺序依次为：B（接种量）＞A（菌种比）＞C（发酵时间）。

图4～6 为两两因素之间的响应面曲线图。通过分析可知，菌种比（A）、接种量（B）和发酵时间（C）任意两因素间的组合，其综合评分皆随工艺参数的提高而呈现先增加后下降趋势，特别是AB 和BC 组合，其曲面变化陡峭，这与方差分析结果一致，说明本试验参数选择合理，在选定范围内的参数进行发酵工艺的优化，能够得到最佳的综合评分。

图4 菌种比和接种量的交互作用对毛酸浆果汁综合评分影响的响应面曲线图Fig.4 Response surface map of the effects of the interaction of strain ratio and inoculum amount on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

2.2.2 最佳发酵工艺的确定

图5 菌种比和发酵时间的交互作用对毛酸浆果汁综合评分影响的响应面曲线图Fig.5 Response surface map of the effects of the interaction of strain ratio and fermentation time on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

图6 接种量和发酵时间的交互作用对毛酸浆果汁综合评分影响的响应面曲线图Fig.6 Response surface map of the effects of the interaction of inoculation amount and fermentation time on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

根据响应面回归模型及Design Expert 10 软件求解方程得到毛酸浆乳酸菌混合发酵最佳工艺参数为：菌种比7∶3.515，接种量1.016%，发酵时间12.09 h，根据上述条件经模型优化预测得到发酵毛酸浆果汁综合评分为25.793 分。考虑到实际生产需要，对参数进行简化，调整为菌种比2∶1，接种量1.0%、发酵时间12 h，经过3 次验证试验，综合评分平均值为25.82分，与模型预测理论值基本一致，说明本模型可信度高，可用于生产中预测毛酸浆果汁混合发酵工艺的结果。

2.3 毛酸浆果汁发酵前后理化指标变化

表7 为发酵前后毛酸浆果汁的理化指标变化情况。由表7 可见，由于乳酸菌在发酵过程中需要消耗糖类作为碳源并产酸[33]，所以发酵后毛酸浆果汁的pH 值、可溶性固形物和总糖含量降低，总酸含量升高。毛酸浆果汁发酵前后的多酚和总黄酮含量分别由（0.259±0.01）g/L 和（0.268±0.01）g/L 提高至（0.281±0.00）g/L 和（0.401±0.00）g/L，菌落总数达到8.31±0.12（lg（CFU/g））。叶盼等[34]选用植物乳杆菌对苹果汁进行发酵，也发现多酚和总黄酮含量显著增加，与本文研究结果一致。说明乳酸菌发酵有益于毛酸浆中功能性物质的转化和溶出，这可能由于乳酸菌在发酵过程中产生酯酶和酚酸脱羧酶。酯酶可促进果汁中结合酚水解释放出游离酚；酚酸脱羧酶能够将复杂的大分子酚类物质转化成小分子酚类物质。另外，发酵过程中产生的酸还可以抑制酚类物质降解。这些都可导致乳酸菌发酵后果汁中酚类物质的含量及种类发生变化[35]。

表7 理化指标Table 7 Physico-chemical indicators

2.4 电子鼻结果

气味是果蔬汁品质的重要评价指标之一。乳酸菌发酵过程中，果蔬汁中的游离氨基酸以及糖类等物质被水解成萜烯类物质，使得烯萜类物质含量增加，产生花果香以及香脂香气，对果蔬汁的气味产生影响[36]。采用优化后的工艺参数发酵毛酸浆果汁，利用电子鼻确定了发酵果汁中的主要气味成分，评价了乳酸菌发酵对毛酸浆果汁气味的影响。

2.4.1 雷达图分析

由图7 可知，传感器S7 对不同处理的样品气味的响应值均为最大，其次是传感器S9 和传感器S2，说明样品中萜烯类物质和无机硫化物含量最高，其次为氮氧化合物和有机硫化物、芳香物质。萜烯类物质广泛存在于植物和动物体内，越来越多的研究表明，萜烯类物质具有抗氧化活性[21]，而硫化物广泛存在于果酒中。发酵前后传感器S7 响应值差异明显，萜烯类物质和无机硫化物含量增加最明显；挥发性香气由强到弱依次为发酵果汁、灭菌发酵果汁、新鲜果汁和灭菌新鲜果汁，这说明乳酸菌发酵处理可以丰富果汁气味，巴氏灭菌处理会降低果汁的气味成分。

图7 雷达分析图Fig.7 Radar diagram

2.4.2 Loading 分析

4 个样品挥发性气味的Loading 分析如图8 所示，传感器的响应值距原点越远，对挥发性气味成分的识别能力越强[37]。由Loading 分析图可知，气味总贡献率为99.944%，对样品挥发性成分贡献率最大的感应器是S7，其次是S2 和S9，其他感应器的贡献率差别不明显，表明影响样品果汁风味差异的主要是萜烯类物质、无机硫化物、氮氧化合物、有机硫化物和芳香物质，其他成分差异不明显。

图8 Loading 分析图Fig.8 Loading diagram

2.4.3 PCA 分析

4 个样品挥发性气味的PCA 分析如图9 所示，每个椭圆代表不同样品挥发性气味成分的数据采集点。分析得出，第一主成分贡献率为93.176%，第二主成分贡献率为6.768%，贡献率之和为99.944%，大于90%，说明基本代表了样品主要的气味特征。在PCA图中，每个椭圆内数据点分布越紧密，说明样品重复性越高；横坐标轴上的间距越大，说明样品之间的差异性越大，由于第一主成分贡献率远高于第二主成分贡献率，所以差异主要体现在第一主成分上。通过图9 可以看出，灭菌前后的毛酸浆果汁差异不显著，发酵前后的毛酸浆果汁差异非常明显。可利用LDA 图进一步分析。

图9 PCA 分析图Fig.9 PCA diagram

2.4.4 LDA 分析

4 个样品挥发性气味的LDA 分析如图10 所示，通过LDA 分析得出，两个主成分贡献率之和为98.28%，高于70%～85%，说明方法可以使用[38]。通过图10 可以看出，样品间离散度大，说明不同处理对毛酸浆果汁的挥发性气味有明显的影响[39]。

图10 LDA 分析图Fig.10 LDA diagram

3 结论

本试验对乳酸菌混合发酵毛酸浆果汁工艺进行了优化，结合实际生产，确定乳酸菌混合发酵毛酸浆果汁最佳工艺参数为：植物乳杆菌与副干酪乳杆菌接种比2∶1，接种量1.0%，在37 ℃下发酵12 h。在此条件下制作的毛酸浆果汁中富含多酚黄酮和萜烯类物质，萜烯类物质为毛酸浆果汁中香气物质种类最多且含量最高的物质，具有柑橘类以及松木香气。本研究为毛酸浆的深加工提供了参考。