液态发酵鸡枞菌的条件优化

赵志琴，张 宁，王 晨，吕荣玉，范志华,2,*，孙 溪,2

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300392）

鸡枞菌（Collybia albuminosa）属伞菌亚纲伞菌目蚁巢伞属[1]，又名鸡宗、鸡丝菇、蚁纵等，夏秋季生长于白蚁巢，并且必须与白蚁共生。鸡枞菌含有较高含量的多糖、多种氨基酸，以及K、Fe、Cu 等多种矿物质元素[2-3]，是一种珍贵的食药真菌[4-5]。鸡枞菌主要分布在我国高海拔的西南、东南地区，如云南、贵州、四川、西藏等省区，我国台湾地区也有分布[6]。

研究表明，多糖具有多种生理功能，如降血脂、预防动脉硬化[7]、抗菌消炎、抗氧化[8]、保护肝脏等，尤其具有抗肿瘤和增强机体免疫力的作用[9]。从20 世纪60 年代开始，多糖活性得到国内外深入的研究，多糖的营养保健、辅助治疗等功能突出，富含多糖的各种天然食品受到人们的推崇。鸡枞菌多糖主要是从菌丝体[10]和子实体[11]中提取，其生物多糖常见的提取方法有水提法、酸提法等[12]。王化远等[13]测定出鸡枞菌菌丝体中多糖含量达6.33%。近年研究发现，超声波[14]和微波辅助提取[15]均能提高多糖得率。张恒等[16]优化了超声辅助提取鸡枞菌多糖工艺，并对其抗氧化特性进行研究，结果表明：鸡枞菌中生物多糖具有较强的抗氧化特性，这也是鸡枞菌具有一定的医疗保健作用的原因之一。

多年来，鸡枞菌以采集野生为主[17]。由于生物多样性的变化，导致野生鸡枞菌的生存压力不断加大，这给野生鸡枞菌资源收集带来巨大危机。此外，从相关鸡枞菌资料来看，国外尚未有人工栽培鸡枞菌的成功案例。至今国内市场上也没有人工栽培成功并批量生产，表明人工栽培鸡枞菌存在一定难度[18]。另外，相比传统栽培，菌种液态发酵是一种更高效且更易于控制的方式[19]。因此，采用液态发酵法对鸡枞菌资源开发和针对提高其生物多糖含量开展研究具有重要意义。本研究以单因素试验为基础，通过响应面分析法探究提高鸡枞菌生物多糖含量的最佳液态发酵条件，为工厂化生产获取鸡枞菌生物多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

鸡枞菌菌种（Collybia albuminosa TZJ816），由研究单位代谢调控实验室保存。

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、NaCl、苯酚、浓硫酸，均为分析纯。

马铃薯采购于农贸市场。

1.1.2 仪器与设备

DK-S24 水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；UV-1800 分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；H2050R 离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；SHZ-A 水浴振荡器，DHP-9162 恒温培养箱：上海博泰实验设备有限公司；SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎仪：北京海天友诚科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配方

综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA 培养基）：20%马铃薯，2.0%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.3%琼脂，0.5%KH2PO4，0.3%MgSO4。

基础发酵培养基：20%马铃薯，2.0%葡萄糖，0.2%蛋白胨。

液体发酵培养基：20%马铃薯，2.0%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.5%KH2PO4，0.3%MgSO4，0.02%NaCl。

1.2.2 鸡枞菌培养及生物多糖提取

1.2.2.1 分离纯化与种子培养

纯化：将鸡枞菌菌种接入CDPA 液体培养基中培养1 d 后，利用涂布平板法，吸取1 mL 培养好的菌液置于提前准备好的CDPA 培养基中，将培养基放置在23 ℃恒温条件下培养，待长出白色菌丝，挑取其单菌落划线分离纯化，待菌丝满管后置于4 ℃环境下保藏备用。

种子培养：挑取鸡枞菌菌丝，接入基础发酵培养基摇瓶（250 mL 三角烧瓶装液100 mL）中。摇瓶密封后以140 r/min 于26 ℃恒温摇床中振荡培养，待出现较多微小菌丝球后置于4 ℃冰箱中保藏备用。

1.2.2.2 液体种培养

分别配制不同碳源添加量、氮源添加量和初始pH 值的液体发酵培养基，将1 mL 液体种接种于液体发酵培养基摇瓶（500 mL 三角烧瓶瓶装液量为150 mL）中。设置不同的培养时间和培养温度，摇瓶密封后置于140 r/min 的摇床中振荡培养。

1.2.2.3 生物多糖的分离提取

对培养结束的液体发酵培养基取样，体积记为V，3 000 r/min 离心15 min，分离上清液，用于测定胞外总糖，差量法测出沉淀物质量（M0），加入20 倍蒸馏水，超声波破碎10 min，然后于95 ℃恒温水浴浸提3 h，再以3 000 r/min 离心10 min，去沉淀，保留上清液，用于测定胞内多糖。

1.2.3 碳源添加量的筛选

使用液态发酵培养基培养鸡枞菌，其中葡萄糖作为优先碳源，添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，pH 值自然，转速140 r/min，培养温度26 ℃，培养3 d 后立即测定胞外总糖、胞内多糖含量和菌体单位体积湿重，筛选适宜的碳源添加量。

1.2.4 氮源添加量的筛选

使用液态发酵培养基培养鸡枞菌，其中蛋白胨作为优先氮源，添加量分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，pH 值自然，转速140 r/min，培养温度26 ℃，培养3 d 后立即测定胞外总糖、胞内多糖含量和菌体单位体积湿重，筛选适宜的氮源添加量。

1.2.5 单因素试验设计

1.2.5.1 培养时间的筛选

选择液体发酵培养基培养鸡枞菌，转速140 r/min，培养温度26 ℃，pH 值自然，分别培养1、3、5、7、9 d，测定胞外总糖、胞内多糖含量和菌体单位体积湿重，筛选适宜培养时间。

1.2.5.2 发酵液初始pH 值的筛选

选择液体发酵培养基培养鸡枞菌，转速140 r/min，培养温度26 ℃，初始pH 值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，培养3 d 后立即测定胞外总糖、胞内多糖含量和菌体单位体积湿重，筛选适宜的发酵液初始pH 值。

1.2.5.3 培养温度的筛选

液态发酵培养基培养鸡枞菌，转速140 r/min，pH值自然，培养温度分别为22、24、26、28、30 ℃，培养3 d 后立即测定胞外总糖、胞内多糖含量和菌体单位体积湿重，筛选适宜的培养温度。

1.2.6 响应面法优化试验设计

通过单因素试验，确定出培养条件的大致水平，以培养时间、培养温度、初始pH 为主要影响因素，以鸡枞菌多糖含量为响应值，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，采用Design-Expert 11.0 软件进行三因素三水平试验[21]，确定液态培养鸡枞菌的最佳培养条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 测定项目与方法

1.2.7.1 菌体单位体积湿重

采用离心法测定。计算公式如下：

式中：ρ 为菌体湿重，g/L；M0离心后菌体质量，g；V 为培养结束后的培养基的取样体积，L。

1.2.7.2 胞外总糖、胞内多糖含量

以葡萄糖计，采用硫酸苯酚法[20]测定。称取葡萄糖0.1 g，转移到50 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，得到浓度为2 mg/mL 的葡萄糖溶液，再取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，加蒸馏水至2 mL，得到浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的葡萄糖溶液，加入5%苯酚1.0 mL，3.0 mL 浓硫酸，摇匀，静置5 min，沸水浴15 min，冷却至室温。以空白为对照，在490 nm 处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线（图1），得到回归方程：y=0.681 6x+0.057 5，R2=0.998 5。取待测液0.2 mL，用蒸馏水稀释成2 mL，按照上述方法测定鸡枞菌胞外总糖、胞内多糖含量。

图1 测定鸡枞菌生物多糖（以葡萄糖计）含量的标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of biological polysaccharide content(calculated by glucose)of Collybia albuminosa

1.2.8 数据处理

采用SPSS26.0 软件对数据进行分析，利用Design-Expert 11.0 软件进行响应面试验的设计与分析。

2 结果与分析

2.1 优先碳源添加量对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响

如图2 所示，葡萄糖添加量低于2.5%时，随着葡萄糖添加量的增加，菌体单位体积湿重和胞内多糖含量呈逐渐上升趋势，胞外总糖含量呈下降趋势，此时鸡枞菌可能处于对数期和稳定前期，作为优先碳源利用，呈现葡萄糖效应；葡萄糖添加量为2.5%时，胞内多糖含量达到最大值3.23 g/L；葡萄糖添加量高于2.5%时，菌体单位体积湿重和胞内多糖呈下降趋势，胞外多糖呈上升趋势，此时鸡枞菌处于稳定后期和逐渐进入衰亡期，代谢产物可能会引起反馈调节，葡萄糖消耗量较少，或者葡萄糖添加量超过2.5%抑制了鸡枞菌的生长，造成鸡枞菌死亡。因此，葡萄糖添加量为2.5%时，最适合鸡枞菌的生长，此结论与王坤等[22]的结论相似。

图2 葡萄糖添加量对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响Fig.2 Effect of glucose addition on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.2 优先氮源添加量对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响

由图3 可以看出，蛋白胨添加量低于0.25%时，菌体单位体积湿重和胞内多糖含量随蛋白胨添加量的增加呈上升趋势，胞外总糖含量呈下降趋势，可能是蛋白胨含量过低不能支持鸡枞菌的生长，当蛋白胨含量增加时，鸡枞菌生长加快，菌丝体开始积累，胞外总糖逐渐被消耗；当蛋白胨添加量为0.25%时，菌体单位体积湿重达到最大值27 g/L，此时菌丝体产生量最多；但蛋白胨添加量超过0.25%后，菌体单位体积湿重和胞外多糖含量呈下降趋势，胞内多糖含量呈上升趋势。这是因为蛋白胨添加过量可能抑制鸡枞菌的生长，或者使鸡枞菌破壁死亡，也可能在鸡枞菌生长后期，菌种处于老化阶段。由此可见，氮源添加量为0.25%时最适合鸡枞菌的生长。

图3 氮源添加量对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响Fig.3 Effect of nitrogen addition on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.3 单因素试验结果

2.3.1 培养时间对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响

如图4 所示，鸡枞菌单位体积湿重呈现先升高后降低的趋势，接种孢子培养7 d，鸡枞菌单位体积湿重积累达到峰值，为23 g/L。培养前期（0～3 d），鸡枞菌快速生长，以消耗碳源为主；进入旺盛期至稳定期（3～7 d），代谢较为旺盛，碳源氮源消耗最大，菌丝积累较多，胞外总糖和胞内多糖出现极值；培养7 d 后，进入衰亡期，细胞可能破壁自溶而溶出多糖。因而鸡枞菌培养液离心测定上清液胞外总糖含量呈现先降低后升高的趋势，而胞内多糖含量反之，说明鸡枞菌较为适宜的培养时间为7 d。

图4 培养时间对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响Fig.4 Effect of culture time on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.3.2 初始pH 对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响

由图5 可见，初始pH 从5 升高到6，鸡枞菌单位体积湿重和胞内多糖含量呈上升趋势，胞外多糖含量呈下降趋势。罗海凌等[23]研究表明，pH 值对食用菌菌丝生长影响较大。本试验中初始pH 值从5 升至6时，菌体单位湿重呈先增加后减小的趋势，说明鸡枞菌不适合强酸性条件下生长；初始pH 值超过6，鸡枞菌单位体积湿重和胞内多糖均呈下降趋势，胞外多糖呈上升趋势，说明初始pH＞6 已经不适合鸡枞菌的生长，此时鸡枞菌生长代谢缓慢。因此，pH=6 最适合鸡枞菌的生长。

图5 初始pH 对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响Fig.5 Effect of initial pH on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.3.3 培养温度对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响

由图6 可见，当培养温度低于26 ℃时，鸡枞菌单位体积湿重和胞内多糖含量呈上升趋势，胞外总糖含量呈下降趋势，这是因为培养温度较低，鸡枞菌活性较低，生长速度较慢；随着培养温度的升高，鸡枞菌活性增强，26 ℃时鸡枞菌单位体积湿重达到最大值25 g/L，胞外总糖含量达到最小值1.012 g/L，胞内多糖含量达到最大值2.76 g/L；当培养温度高于26 ℃时，鸡枞菌单位体积湿重和胞内多糖含量呈下降趋势，胞外总糖含量呈上升趋势，这是因为培养温度过高会造成鸡枞菌活性下降或失活，其利用培养基中葡萄糖的能力降低。说明培养温度为26 ℃时最适合鸡枞菌的生长。

图6 培养温度对鸡枞菌液胞外总糖、胞内多糖含量和单位体积湿重的影响Fig.6 Effect of culture temperature on extracellular total sugar,intracellular polysaccharide contents and wet weight per unit volume in Collybia albuminosa fermentation liquid

2.4 响应面优化结果

2.4.1 响应面试验结果与方差分析

试验以随机次序进行，将试验所得的多糖含量用Design-Expert 11.0 软件进行分析，并得出响应面分析图、回归拟合方程，以及方差分析表。响应面试验设计与结果见表2。

通过对表2 试验数据进行分析，拟合得出关于培养时间（X1）、培养温度（X2）、初始pH（X3）的二次多项式方程：

表2 中心组合设计试验结果Table 2 Experimental results of central combination design

对模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

由表3 可知，该回归模型是极显著的（P＜0.01），X1对响应值影响显著（P＜0.05），X2、X3、X1X3、X21、X22对响应值影响极显著（P＜0.01），X1X2、X2X3、X23对响应值影响不显著，同时由各因素均方值可以得出影响鸡枞菌生物多糖含量的各因素排序为：X3＞X2＞X1。该模型失拟项P 值为0.592 7，失拟项用来表示所用模型与试验拟合的程度，这意味着失拟项是不显著的，即模型与试验值的差异较小。同时模型的决定系数R2＝0.962 6，说明鸡枞菌生物多糖含量的试验值与预测值之间有很好的拟合度。

2.4.2 各因素交互作用的响应面分析

响应面图形是响应值Y 对各试验因子X1、X2、X3的函数图形，从响应面图形上可以形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[24]。响应面分析等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响[25]。图8～10中的响应面展示了某两个因素的交互作用对液体培养鸡枞菌生物多糖含量的影响。由等高线图可知，多糖含量Y 存在最高值，各因素均有一个对应的最适值。

图7 培养时间与培养温度的交互作用对鸡枞菌多糖含量影响的响应面图Fig.7 Response surface diagram of effect of culture time and temperature interaction on polysaccharide content in Collybia albuminosa

图8 培养温度与初始pH 的交互作用对鸡枞菌多糖含量影响的响应面图Fig.8 Response surface diagram of effect of culture temperature and initial pH interaction on polysaccharide content in Collybia albuminosa

图9 培养时间与初始pH 的交互作用对鸡枞菌多糖含量影响的响应面图Fig.9 Response surface diagram of effect of culture time and initial pH interaction on polysaccharide content in Collybia albuminosa

2.4.3 最佳培养条件的确定

对方程进行最优求解得到，培养条件的最优组合为：培养时间7.65 d，培养温度27.60 ℃，初始pH为7，预测的生物多糖含量为2.67 g/L。考虑到实际操作，将最优解修正，即：培养时间8 d，培养温度27.60 ℃，初始pH 为7。为了检验优化结果的可靠性，采用修正后的组合条件进行3 次平行试验，得出鸡枞菌生物多糖平均含量为2.71 g/L，与理论预测值2.67 g/L基本吻合。因此，利用响应面分析法优化得到的鸡枞菌的培养条件真实可靠，具有很好的实用价值。

3 结论

在单因素试验的基础上，以培养时间、培养温度、初始pH 为试验因素，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，采用Design-Expert 11.0 软件进行三因素三水平响应面试验，以多糖含量为考察指标，对鸡枞菌液体培养条件进行优化。响应面试验得到鸡枞菌液体培养的最佳条件为：葡萄糖添加量2.50%，蛋白胨添加量0.25%，培养时间8 d，培养温度27.6 ℃，初始pH 为7，在此条件下，鸡枞菌生物多糖含量为2.71 g/L。