非布司他对高尿酸血症大鼠Treg/Th17平衡及血管内皮功能的影响

陈凝, 孙红, 郑炜平, 周梦, 刘剑雯, 严青, 高飞, 林禾

(1. 福建省立金山医院内科,福建 福州 350001； 2. 福建省立医院药学部,福建 福州 350001； 3. 福建省立医院风湿免疫科,福建 福州 350001)

高尿酸血症在中国已成为继高血压、高血脂和高血糖后的“第四高”,高尿酸血症患者更易发生冠心病、脑卒中等多种心脑血管疾病[1-2]。非布司他是一种新型选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂,自2009年美国FDA批准上市后广泛用于痛风及高尿酸血症的治疗[3]。目前关于非布司他是否会改善血管内皮功能仍有争议,国内外多家研究机构也相继发布相关研究结果,但结论不一[4-5]。长期非布司他治疗是否可以降低心脑血管疾病的风险目前并不确定,有必要做进一步的研究。

调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)和辅助性T细胞17(helper T cell 17, Th17)是CD4+T淋巴细胞的不同亚群。Treg细胞具有抑制免疫的作用,以利于机体维持免疫稳态。Th17细胞通过分泌IL-17等促炎细胞因子,促进机体的炎症反应。越来越多的证据表明Treg/Th17失衡在冠心病的发生发展中起重要作用[6],其可能机制为免疫炎症反应参与了动脉粥样硬化斑块的形成[7]。近年也有研究发现痛风患者Th17细胞增多、Treg/Th17下调,提示Treg/Th17失衡可能参与了痛风的发病。本研究拟观察非布司他对高尿酸血症大鼠Treg/Th17平衡、血管内皮功能的影响,探讨其治疗高尿酸血症的可能机制,为解决上述临床问题提供依据。

1 材料和方法

1.1 动物

雄性SD大鼠32只,SPF级,8周龄,体重200～250 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号:SCXK(沪)2009-3。动物实验经福建医科大学实验动物中心伦理委员会批准。

1.2 药品和试剂

酵母膏(北京奥博星生物技术有限公司),氧嗪酸钾(中国MACKLIN公司),非布司他(江苏万邦生化医药集团有限公司),别嘌醇片(重庆科瑞制药有限责任公司)。佛波酯、离子霉素及莫能霉素(美国Pepro Tech公司)。大鼠抗CD4-FITC 、抗CD25-APC、抗Foxp3-PE及抗IL-17A-APC(美国BD公司)。血清尿酸、一氧化氮(NO)及内皮素-1(ET-1)ELISA试剂盒(美国R&D公司),血清IL-6 ELISA试剂盒(美国RayBiotech公司),苏木素染液(北京中杉金桥生物技术有限公司),伊红染色液及改良Masson三色染色液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 动物造模、实验分组及给药

32只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、非布司他组和别嘌醇组,每组8只。模型组予以高酵母饲料(含20%酵母膏)及氧嗪酸钾灌胃(200 mg·kg-1·d-1)。非布司他组和别嘌醇组除了给予高尿酸血症大鼠造模方案外,还分别予以非布司他(10 mg·kg-1·d-1)和别嘌醇(50 mg·kg-1·d-1)灌胃。正常对照组大鼠灌胃生理盐水。治疗方案维持6周。用药结束后,乙醚麻醉大鼠。大鼠颈动脉取血,血清保存于-80 ℃。分离大鼠胸主动脉,用4%甲醛固定,石蜡包埋。

1.4 血清尿酸、IL-6、NO和ET-1的含量检测

ELISA法检测血清尿酸、IL-6、NO及ET-1含量,按照试剂盒说明书进行。

1.5 流式细胞术检测大鼠脾脏Treg及Th17的水平

取大鼠脾脏研磨制成单细胞悬液,红细胞裂解液裂解红细胞,1 600 r/min离心5 min,PBS重悬并计数,将细胞终浓度调至1×107/mL。将单细胞悬液用流式管分两管,分别检测Treg、Th17细胞。

检测Treg细胞:取200 μL细胞悬液,加入抗CD4-FITC 及抗CD25-APC(1 ∶200稀释), 室温避光孵育20 min,PBS洗涤后加入固定破膜剂,固定破膜1 h后,PBS洗涤,加入抗Foxp3-PE(1 ∶100稀释)避光孵育 30 min,PBS洗涤后Calibur流式仪上机检测。

检测Th17细胞:取200 μL细胞悬液,以200 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬,加入佛波酯(0.1 μg/mL)、离子霉素(5 μg/mL)、莫能霉素(25 μg/mL),于细胞培养箱中刺激4 h,PBS洗涤,加入抗CD4-FITC(1 ∶200稀释), 避光孵育20 min,PBS洗涤后加入细胞固定破膜液,固定15 min,PBS洗涤,加入抗IL-17A-APC(1 ∶100稀释)避光孵育30 min,PBS洗涤后Calibur流式仪上机检测。

1.6 胸主动脉病理学观察

取石蜡包埋的大鼠胸主动脉组织,切片,用二甲苯及不同浓度乙醇脱蜡、水化,苏木素及伊红HE染色,并用Masson复合液染色,光镜下观察主动脉组织的病理变化。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清尿酸、IL-6含量比较

模型组较正常对照组大鼠血清尿酸、IL-6含量明显升高(P<0.05); 非布司他和别嘌醇治疗后血清尿酸、IL-6含量明显降低(P<0.05)；与别嘌醇组相比,非布司他组血清尿酸、IL-6含量降低更为显著(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠血清NO、ET-1含量比较

模型组较正常对照组大鼠血清NO含量明显降低(P<0.05),ET-1含量明显升高(P<0.05);非布司他和别嘌醇治疗后血清NO含量明显升高(P<0.05),ET-1含量明显降低(P<0.05)；非布司他与别嘌醇对两者的作用无显著差异。见表1。

表1 各组大鼠血清尿酸、IL-6、NO和ET-1含量比较

2.3 各组大鼠脾脏Treg/Th17细胞水平比较

流式结果如图1所示,正常对照组、模型组、非布司他组和别嘌醇组脾脏Treg细胞百分比分别为(11.84±2.37)%、(9.30±3.15)%、(13.89±3.58)%和(11.08±2.57)%,各组间Treg细胞百分比无明显差异(F=2.11,P=0.12)。正常对照组、模型组、非布司他组和别嘌醇组脾脏Th17细胞百分比分别为(1.55±1.04)%、(3.20±1.40)%、(1.81±0.88)%和(2.84±0.83)%,经方差检验差异有统计学意义(F=3.92,P<0.05),进一步行LDS-t检验,非布司他组Th17细胞百分比较模型组明显下降(P<0.05)。

图1 流式细胞术检测大鼠脾脏Treg和Th17细胞水平

正常对照组、模型组、非布司他组和别嘌醇组脾脏Treg/Th17比值分别为13.38±10.46、4.27±3.30、10.34±6.11和4.17±1.13,经方差检验差异有统计学意义(F=3.29,P<0.05),进一步行LDS-t检验,非布司他组Treg/Th17比值较模型组明显上升(P<0.05)。

2.4 各组大鼠主动脉HE染色和Masson染色结果

HE染色显示,模型组大鼠主动脉见内皮细胞呈立方形样肿胀、平滑肌纤维层排列紊乱；非布司他组和别嘌醇组大鼠主动脉内膜层内皮细胞肿胀明显减轻,其中非布司他组改善更明显。Masson染色显示,模型组大鼠主动脉中可见纤维组织增生,胶原纤维沉积；非布司他组和别嘌醇组大鼠主动脉内增生纤维组织和沉积的胶原纤维减少。非布司他组与别嘌醇组两组间改善程度未见明显差异,见图2。

图2 各组大鼠主动脉HE及Masson染色(×400)

3 讨论

高尿酸血症和痛风的患病率呈逐年上升趋势,我国最近的流行病学调查显示,高尿酸血症的患病率为13%[8],而痛风的患病率为2%[9]。临床观察到高尿酸血症与心血管疾病有密切联系,可能与高尿酸血症损伤血管内皮功能有关。有研究表明,高尿酸血症患者抗氧化能力降低,清除自由基的能力受到抑制,炎症因子水平升高[10]。近年来研究表明黄嘌呤氧化酶途径是心血管系统活性氧的主要来源[11],由该途径介导的氧化应激在心血管疾病的病理生理过程中起重要作用,如慢性心力衰竭、血管内皮功能障碍等。别嘌醇是黄嘌呤氧化酶的抑制剂,目前的动物实验及临床试验均表明别嘌醇具有一定的抗氧化能力,可抑制氧化应激介导的心血管系统代谢紊乱,从而发挥心血管保护作用[12]。非布司他是高选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂的降尿酸药物,药效和安全性优于别嘌醇。但非布司他是否也具有血管内皮保护功能,目前研究仍有争议。CARES的临床研究结果显示,相比于别嘌醇,非布司他会增加痛风患者的心血管死亡风险[13]。但也有临床研究如FREED[14]、FEATHER[15]队列研究显示,相比于别嘌醇或安慰剂,非布司他并未增加心血管事件和心血管死亡风险。

Treg细胞可抑制炎症反应,而Th17细胞可促进炎症反应,两者协同发挥作用,Treg/Th17平衡维持了机体的免疫稳态。有多项临床研究表明,冠心病患者中存在Treg/Th17失衡,并且与冠心病的病情严重程度及预后有关[16]。其可能机制为Treg/Th17失衡导致机体的炎症反应,从而引起血管内皮损伤,加速动脉粥样硬化的形成。也有研究动态监测了急性痛风性关节炎大鼠的脾脏Treg和Th17细胞,结果发现Th17细胞比例增多、Treg/Th17比值在病程中持续下调[17]。但目前相关研究较少,痛风及高尿酸血症患者的Treg和Th17细胞变化仍有待探索。

Treg和Th17平衡最重要的影响因素是细胞因子。IL-6在TGF-β存在的情况下,可促进Th17的分化,同时IL-6还可以抑制TGF-β诱导的Treg分化,提示IL-6是决定Treg/Th17平衡的关键因素之一[18]。研究发现高尿酸血症患者血清IL-6水平明显高于健康者[19],其可能原因如下:高尿酸血症患者尿酸盐结晶沉积于血管壁,引起血管内膜的慢性炎症损伤,单核细胞大量黏附于血管内膜上并释放IL-6等炎症因子；尿酸盐本身也可促进白细胞释放IL-6等炎症因子[20-21]。本研究结果显示高尿酸血症大鼠血清IL-6含量升高,非布司他可显著降低血清IL-6含量。本研究结果与Khan等[22]的结果一致,他们认为非布司他降低IL-6可能与其抑制NF-κB炎症信号通路有关。本研究还发现非布司他可恢复Treg/Th17平衡。因此,我们推测非布司他可能通过抑制IL-6水平改善高尿酸血症Treg/Th17失衡。

血管内皮细胞具有重要的内分泌功能,可分泌NO、ET-1等血管活性物质。NO、ET-1的水平可反映内皮细胞功能状态[23]。本研究观察了非布司他对高尿酸血症大鼠内皮功能的治疗作用,发现非布司他可升高高尿酸血症大鼠血清NO含量,降低ET-1含量,并且可改善高尿酸血症大鼠主动脉病理结构。

综上所述,非布司他干预可降低高尿酸血症大鼠血清IL-6水平,纠正Treg/Th17失衡,改善血管内皮功能。本研究结果为探讨非布司他治疗高尿酸血症的机制提供了新的理论依据。