青叶胆有效部位对胶原诱导关节炎小鼠及关节组织中MMP-9的影响*

耿鑫 贾娜 张建平

(1.西安市第九医院，陕西 西安 710054；2.空军军医大学西京医院，陕西 西安 710032；3.西安工会医院，陕西 西安 710100)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫系统疾病[1-2]，其临床症状表现为关节滑膜炎症、血管翳的形成，并最终导致关节软骨病变，严重者关节畸形甚至残废[3-4]。青叶胆来源于龙胆科獐牙菜属植物青叶胆(SwertiamileensisT.N.Hoet W.L.Shih,SWE)的全草，别名弥勒獐牙菜、金鱼胆、走胆药，生长于我国西藏、云南、川西等海拔约为1300～1700 m的山上，是一味使用历史悠久的藏药。可用于治疗黄疸、湿热病、赤尿涩痛等症[5-6]。青叶胆作为民族用药已被佤医常用青叶胆和龙胆草配伍治疗肝炎、胆囊炎等[7-9]，本课题组之前已对青叶胆药材进行了质量标准研究，文献报道青叶胆可调节T淋巴细胞亚群从而提高免疫功能[10-11]，然而青叶胆发挥抗炎作用的靶点和机制尚不明确。本文拟构建胶原诱导关节炎模型，通过研究该模型中的关节炎相关评价指数、关节病理学变化以及基质金属蛋白酶的水平，来阐述青叶胆在RA发生发展中的保护作用和分子作用机制，为青叶胆防治类风湿关节炎提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 MSE1203S-DE电子天平(Sartorius)；Eppendorf 5417R高速冷冻离心机，RM2235切片机(德国LEICA公司)；匀浆器(德国IKA公司)，HistoStar包埋机(Thermo)；IX71倒置荧光显微镜(Olympas)。

1.2试药 SWE购于安国市涵博堂中药材销售有限公司，并经西北大学生命科学与医学院王亚洲教授鉴定，粉碎后过60目筛。地塞米松片(每片0.75 mg，批号：12020293)购于天津太平洋制药有限公司；鸡Ⅱ型胶原(批号202009)购于美国Sigma公司；Freund complete adjuvant和Freund incomplete adjuvant(批号：F56354)购于美国Chondrex公司；HE染色剂(批号：G1120)购于北京索莱宝科技有限公司；MMP9(货号：AM1975a)单克隆抗体购于abgent公司；小鼠白细胞介素(IL) -1β(批号：M420AB)、IL-6(批号：M620)、人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(货号：12-7321-82)均购于Invitrogen公司。

1.3实验动物 选取10～14周龄的雄性C57BL6J小鼠，购自第四军医大学试验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2007-0007。分笼饲养，自由摄食和饮水，确定动物状态良好。

2 方法

2.1SWE的制备 将阴干的青叶胆200 g 粉碎，过20 目筛，用少量75%甲醇拌匀并浸泡12 h，待其润胀后用75%乙醇进行渗漉提取，薄层色谱(TLC)下检视，直至薄层板上几乎看不到斑点时停止渗漉。合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，最后将提取液浓缩成浸膏状，即得SWE(经HPLC测定，提取物中龙胆苦苷含量为50.23%、落苷酸含量为15.29%、獐牙菜苷含量为11.65%、獐牙菜苦苷含量为10.18%)。将所制SWE密封，灭菌，于4 ℃冰箱中冷藏，备用。

2.2模型构建与分组 将鸡二型胶原(Chicken type Ⅱ,CⅡ)溶解于0.1 M的冰醋酸中，使其浓度为4 mg·mL-1。相同体积胶原与弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant，CFA)混合后充分匀浆乳化制成乳剂。免疫动物：在小鼠尾根部位皮内注射0.1 mL混合乳剂，其中含200 mg结核分枝杆菌和100 mg二型胶原。加强免疫：首次注射14 d后重复上述免疫步骤，并要远离第一次的注射部位。对照组注射同体积的生理盐水[12-13]。在实验第14 d开始进行查看并记录关节炎指数(AI)，按AI值≥2分为造模成功。

将动物随机分成5组，每组8只，分别为正常组、CIA模型组、阳性药(地塞米松，0.25 mg·kg-1)组即DEX组、SWE组(25 mg·kg-1，L组)和SWE组(50 mg·kg-1，H组)。各组灌胃给药，一次·d-1，共持续28 d，正常组和模型组灌胃同体积的生理盐水。

2.3相关指数评估 评估关节炎指数(AI)采用5级评判标准[7-8]：0分为无红肿；1分为关节轻度肿胀；2分为小趾关节及足趾关节肿胀；3分为踝关节以下足爪肿胀；4分代表踝关节在内的全部足爪肿胀并且不能负重。小鼠继发侧足爪AI评分之和即为该小鼠的AI评分(总分为16分)。

脾脏指数(splenic index，SI)和胸腺指数(thymusindex，TI)：评估待小鼠死亡后解剖并摘取小鼠胸腺和脾脏，称湿重，根据公式：脾脏指数=脾脏质量(g)/体重(g)，胸腺指数=胸腺质量(g)/体重(g)，分别计算。

2.4关节病理学变化 采用hematoxylin-eosin staining染色法对小鼠关节染色。取动物后踝关节，使用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，常规脱水，石蜡包埋，5 μm切片，苏木素-伊红染色，200倍下显微镜观察小鼠组织病理学改变。

2.5血清中炎性因子的含量 采用ELISA法进行测定。取血后3 000 r·min-1离心10 min，取上清按照ELISA试剂盒说明书分别测定TNF-α，IL-1β和IL-6的含量。

2.6测定关节滑膜中MMP-9的蛋白表达 采用Western blot法检测蛋白水平。取新鲜小鼠关节组织100 mg置于匀浆器，冰上研磨提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE电泳，5%的浓缩胶80 V，25 min，15%的分离胶120 V，40 min；150 A转膜2 h；脱脂奶粉封闭2 h；加入一抗(MMP-9和β-actin，1∶1 000)置于摇床4℃过夜；TBST洗膜3次，每次15 min ；二抗(1∶1 200)于室温孵育2 h；TBST溶液洗膜3次，每次15 min；加入显影液配制1 mL(1∶1)，放入化学发光仪检测；采用Quantity One 软件分析条带，计算分析MMP-9和β-actin条带的灰度比值。

3 结果

3.1对关节炎指数(AI)的影响 与正常组相比，CIA模型组、SWE H组、SWE L组小鼠AI值升高(P<0.05)；与CIA模型组比较，地塞米松组和SWE H组AI值从第7 d开始呈显著性降低(P<0.05)，SWE L组从第14 d开始AI值降低(P<0.05)，结果见表1。

表1 SWE对AI值的影响

3.2对脏器指数(SI和TI)的影响 与正常组比较，CIA模型组、SWE H组、SWE L组的小鼠SI、TI值升高(P<0.05)；与CIA模型组比较，地塞米松和SWE H组、SWE L组均能使SI和TI值的减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

表2 对SI和TI值的影响

3.3对小鼠关节组织病理学变化的影响 在显微镜下可看到：与control组相比较，CIA组滑膜排列不够紧密，出现炎性细胞浸润，并且伴有淋巴细胞增生及血管翳形成的现象；与CIA模型组相比，DEX组及SWE H组滑膜排列整齐，组织紧密，炎性细胞减少，SWE L组较模型组病理学变化不明显，结果详见图1。

图1 对小鼠踝关节滑膜组织病理变化的影响(HE，×200)

3.4对炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平的影响 与正常组相比，CIA模型组中炎性因子(IL-1β、IL-6 和TNF-α)的含量分别为(24.63±1.41)、(90.76±5.09)和(16.23±4.21) pg·mL-1(P<0.05)；与CIA组相比，DEX组及SWE H、SWE L组血清IL-1β，IL-6 和TNF-α的含量均下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 对CIA小鼠血清中IL-1β，IL-6 和TNF-α含量的影响

3.5对滑膜组织中MMP-9含量的影响 经western bloting法检测，CIA模型组与正常组相比，关节滑膜组织中MMP-9的蛋白表达水平是正常组的3.6倍(P<0.05)，而较CIA模型组，DEX组降低至正常组的2.2倍，SWE H组和SWE L组分别降低至正常组的1.9倍和2.5倍，数据均具有显著性差异(P<0.05)。结果证实SWE能够抑制MMP-9在CIA小鼠滑膜组织中的高表达水平。见图2。

4 讨论

全球RA的发病率为0.5%～1.0%，是一种以反复发作的四肢对称性多关节肿胀、疼痛、功能障碍甚至关节畸形为特点的慢性自身免疫性疾病，关节侵蚀、软骨破坏及慢性滑膜炎是临床常见表现，甚至会导致残废，极大影响到患者的生存质量[14]。基质金属蛋白酶(MMP)在细胞外基质降解及重构的中起到重要作用，对细胞外基质有高效的降解能力，从而导致软骨损伤[15]。MMPs会在关节炎软骨交界间隙及关节的其他部位呈现高水平表达。其作用机制可能为以下两条途径：① MMPs可降解关节软骨及骨质；②血管再生时，MMPs可降解微血管基底膜和间质成分，进而形成血管翳。研究显示，降低关节组织中MMP-9的表达，能够有效地保护RA病人的关节损伤[16-17]。因此，将MMPs作为RA的靶点成为了现阶段研究治疗RA的焦点。

青叶胆来源于龙胆科獐牙菜属植物青叶胆的全草，具有抗炎、镇痛、解痉的作用[1]。本课题组的前期研究发现，同属龙胆科植物的秦艽提取物具有显著的抗炎、镇痛作用[18-20]，青叶胆和秦艽化学成分组成相似，因此本文我们探讨了同属植物药青叶胆是否具有抗RA的作用，并进一步考察其究竟是通过何种作用机制来发挥抗RA作用的。实验数据表明，SWE H组和SWE L组均能显著抑制CIA小鼠的AI指数和脏器指数(SI、TI)，SWE H组中滑膜排列整齐，组织紧密，炎性细胞减少，SWE H和SWE L显著抑制血清中炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平，抑制MMP-9在CIA小鼠关节滑膜组织中的高表达。综上所述，本实验首次证实SWE能够改善CIA小鼠炎症状态，其作用机制可能是通过降低CIA小鼠血清中炎性因子(IL-1β，IL-6和TNF-α)的含量，以及抑制MMP-9在关节组织中的高表达水平，从而发挥治疗类风湿关节炎的疗效，为深入探讨青叶胆醇提物抗RA作用机制提供了理论支撑，为青叶胆资源的开发提供帮助。

由于目前关于青叶胆研究较少[21]，其中具体是哪些成分为抗RA的药效物质基础，以及具体的分子作用机制有待课题组深入考察。