广西地区男性不育患者AZFc部分缺失与生精障碍的关系研究▲

莫定敢 唐兰艳

广西壮族自治区生殖医院，南宁市 530218

近年来，我国不孕不育患者数量逐年增多，不孕不育已成为我国重要的医学和社会问题。调查结果[1]显示，不孕不育症的一半原因在于男性，而其中超过30%的原发性男性不育与Y染色体微缺失所导致的生精障碍有关。研究[2-6]发现，男性Y染色体上“无精子因子”区(AZF)是实现生精及维持生精功能不可或缺的因子，AZF部分缺失是男性生精障碍的重要影响因素，其中大部分的AZF缺失发生在AZFc区(其他两个区域为AZFa、AZFb)，而男性遗传性生精障碍与AZFc区中的DAZ基因拷贝数差异有关；男性生精障碍患者的AZFc缺失在不同地域、种族之间存在较大差异。为探讨广西地区男性不育患者AZFc部分缺失与生精障碍的关系，本研究选取广西地区男性生精障碍患者268例以及同期正常体检者100例为研究对象进行了检测分析。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月至2021年9月在我院接受诊治的不育男性患者268例为患者组，年龄26～45岁。纳入标准：(1)根据临床检查结果、参照男性不育的诊疗指南[7]确诊为男性不育；(2)祖籍为广西地区。排除标准：(1)梗阻性无精子症患者；(2)精索静脉曲张、隐睾、附睾损伤患者；(3)输精管发育不良患者；(4)泌尿生殖道感染患者；(5)低促性腺激素性性腺功能减退症患者。根据精液检查结果、参照世界卫生组织标准[8]将患者分为无精子组(精子浓度<0.1×106/mL)88例、严重少精组(精子浓度<5×106/mL)103例、少精组[精子浓度(5～20)×106/mL]77例。参照不育患者的年龄选取同期体检正常者100例为对照组(精子浓度大于20×106/mL)，年龄26～45岁。两组研究对象均签署检测研究知情同意书。本研究经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 AZFc缺失筛查 抽取研究对象外周静脉血5 mL，分离淋巴细胞，使用全血DNA提取试剂盒[亚能生物技术(深圳)有限公司]提取DNA，储存于-20℃冰箱备用。采用多重PCR法对序列标签位点(STS) 进行检测，分析AZFc缺失情况。设置6个序列标签位点：SY160(上游5′-TACGGGTCTCGAATGGAATA-3′，下游5′-TCATTGCATTCCTTTCCATT-3′)；SY254(上游5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′，下游5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′)；SY1291(上游5′-TAAAAGGCAGAACTGCCAGG-3′，下游5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′)；SY1125(上游5′-GTGGGGGTTTCACATTATGG-3′，下游5′-GGTCACAGACTCACATTTAAGCA-3′)；SY1191(上游5′-CCAGACGTTCTACCCTTTCG-3′，下游5′-GAGCCGAGATCCAGTTACCA-3′)；SY1201(上游5′-CCGACTTCCACAATGGCA-3′，下游5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′)。总反应体系主要包括：缓冲液、引物、dNTP、Taq酶、无核酸水，共25 μL。反应条件：预热95℃ 3 min，95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环，延伸72℃ 10 min。

1.2.2 DAZ基因拷贝数分析 对AZFc部分缺失患者进一步进行DAZ基因拷贝数检测。采用PCR-RFLP分析DAZ基因中SNV 5(上游5′-CCTGGAGATTTCTTGTATATGGAA-3′，下游5′-CTTACAAACATTATGCTGAGTGAA-3′)，检测DAZ 基因拷贝数差异。SNV 5的特定片段分为DAZ1/2与DAZ3/4。另选DAZ基因外Y染色体上M159位点(上游5′-GCTAGTAGTGGTGCTTGATAA-3′，下游5′-TTTAAAAAGTACCAGAAGAAGG-3′)作为内参以消除 DNA 浓度不均产生的影响。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析。计数资料用%描述，组间比较用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不育患者与体检正常者的AZFc缺失率比较 268例不育患者中，存在AZFc部分缺失78例，缺失率为29.10%，对照组体检正常者的AZFc缺失率为3.00%。无精子组不育患者的AZFc缺失率明显高于少精组及对照组，严重少精组不育患者的AZFc缺失率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不育患者与体检正常者的AZFc缺失率比较 [n(%)]

2.2 268例患者STS各序列位点的AZFc缺失分布 检测分析结果显示，SY254序列位点的AZFc缺失率最高为34.70%，SY1125序列位点的AZFc缺失率为23.13%，SY160序列位点的AZFc缺失率为16.42%。见表2。

表2 268例患者STS各序列位点的AZFc缺失分布

2.3 AZFc区域DAZ基因拷贝缺失情况比较 对81例AZFc部分缺失者(78例患者，3例体检正常者)进行 DAZ 基因拷贝缺失分析。结果显示，DAZ1/2拷贝缺失者有30例，DAZ3/4 拷贝缺失者有55例，部分不育症患者存在DAZ1/2与DAZ3/4共缺失情况。无精子组、严重少精组、少精组、对照组研究对象的DAZ1/2基因拷贝缺失率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但4组间的DAZ3/4拷贝缺失率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，无精子组、严重少精组、少精组患者的DAZ3/4拷贝缺失率均明显高于对照组 (P<0.05)。见表3。

表3 AZFc区域DAZ基因拷贝缺失情况比较 [n(%)]

3 讨 论

男性不育的遗传因素逐渐受到业内的重视，研究发现，男性Y染色体AZFc缺失是男性生精障碍的重要因素，AZFc中的 DAZ 基因拷贝缺失与男性原发性无精、严重少精症的关系尤为密切[9-10]。对AZFc部分缺失进行检测有助于对男性原发性无精子症和严重少精子症患者进行辅助生育精子质量筛选。综合分析国内外相关研究结果发现，男性原发不育患者AZFc部分缺失的发生率可能与其种族、地域及基因多态性相关。广西地区男性不育形势日益严峻，对广西地区男性不育患者AZFc缺失发生率展开调查，可进一步弄清AZFc缺失与男性原发不育症的关系。

本研究对268例广西地区不育男性患者进行检测分析发现，患者的AZFc缺失率为29.10%，少精组、严重少精组、无精子组患者的AZFc缺失率依次升高，提示AZFc缺失率越高男性的生精障碍越严重。在本研究中，无精子症患者的AZFc缺失率高达40.91%，严重少精症组患者的AZFc缺失率达26.21%，比既往文献报道的AZFc缺失率稍高[3,11]，可能与各研究样本的纳入标准、排除标准或患者所在地区不同有关。AZFc与男性生精密切相关的DAZ基因拷贝缺失是AZFc区缺失率高的核酸基础，本研究所选的STS均为AZFc区常见的序列位点，已覆盖AZFc区，在男性原发无精子症及严重少精子症患者辅助生育精子质量筛选与预后评估中，能够很好地减少因AZFc垂直传递带来的干扰。

男性Y染色体上有两个呈反向排列的DAZ基因拷贝区，即DAZ1/2与DAZ3/4，二者拷贝数差异可导致不同程度的生精障碍[12]。本研究结果显示，无精子组、严重少精组、少精组、对照组研究对象的DAZ1/2基因拷贝缺失率比较差异无统计学意义，但无精子组、严重少精组、少精组患者的DAZ3/4基因拷贝缺失率与对照组比较，差异有统计学意义，提示DAZ3/4基因缺失与男性生精障碍的关系要比DAZ1/2基因缺失与男性生精障碍的关系更为密切。在本研究中，DAZ3/4基因拷贝缺失均出现在无精子症、严重少精子症及少精症患者中，而DAZ1/2拷贝缺失则在少精组、正常对照组中发生的概率较高，与既往文献报道的结果[13-15]存在一定差异，这可能是因研究对象的种族及地域差异所致。导致男性原发性生精障碍发生的遗传原因有多种，DAZ基因缺失只是其中之一，在一些DAZ基因缺失的生精障碍患者中还可能同时存在基因倒位或重复的情况，需进一步深入研究。

综上所述，AZFc缺失率越高广西地区男性生精障碍患者的生精障碍越严重，但AZFc部分缺失并不会导致绝对不育，及早检测AZFc缺失有助于指导患者治疗，对优生优育具有重要的意义。