骨转换生化标志物的研究进展

田琳琳 冯正平

重庆医科大学附属第一医院内分泌科，重庆 400016

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨组织微结构受到破坏导致骨骼脆性增加，骨折风险增加的慢性疾病。骨质疏松和低骨量在老年人中越来越普遍，相对于骨密度检查的不便及检测延迟，骨转换生化标志物可更早反映骨转换的动态。骨转换标志物分为骨形成生化标志物和骨吸收生化标志物，骨形成生化标志物包括骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(P1NP)、Ⅰ型前胶原羧基端前肽(P1CP)、骨形态发生蛋白(BMPs)、骨保护素(OPG)等；骨吸收生化标志物包括Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)、Ⅰ型胶原羧基末端肽(CTX)、酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、吡啶啉(PYD)、脱氧吡啶啉(DPD)等。目前骨转换生化标志物已广泛应用于临床，新的骨转换生化标志物也在不断被发现，本文就国内外一些新的骨转换生化标志物研究进展作一综述。

1 骨钙素

骨钙素(osteocalcin，OC)又被称为骨γ-羧基谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGLAP)，是BGLAP编码的由非增殖期的成骨细胞特异合成并分泌的骨组织中含量最丰富的维生素K依赖的非胶原蛋白，参与骨基质的合成、维持骨矿化。成骨细胞分泌的骨钙素含有3种γ-羧基谷氨酸残基，它们与骨羟基磷灰石基质具有高亲和力。当骨吸收时，由于破骨细胞吸收腔隙内的pH值降低，骨钙素上的羧基被清除，降低了其对骨骼的亲和力，羧化不全的骨钙素被释放到循环中，所以测定血清中的骨钙素水平既能反映成骨细胞活性，又能反映骨转换的程度[1]。

Karsenty小组最早通过敲除Bglap和Bglap2基因产生骨钙素缺乏(Ocn-/-)小鼠，发现Ocn-/-小鼠表现出骨小梁和皮质骨的体积均增加，但其成骨细胞未增加、破骨细胞的数量增加；表明骨钙素抑制成骨细胞功能和破骨细胞的生成，是骨形成的负性调节因子。对纯B6基因背景下的骨钙素缺失(OC-/-)小鼠研究发现[2]，与野生型小鼠相比，OC-/-小鼠骨小梁体积、骨小梁体积/总体积、连接密度和数量均显著增加。OC-/-小鼠骨矿物中酸性磷酸盐含量增加、血清P1NP浓度升高，表明其骨形成增加。另一方面，野生型小鼠和OC-/-小鼠的血清CTX浓度无显著差异，表明其不影响骨吸收。最近有研究通过Neo基因替换Bglap和Bglap2基因生成骨钙素缺乏(Ocn-/-)小鼠[3]，发现野生型和Ocn-/-小鼠股骨小梁的骨体积、厚度和数量无显著差异，同时股骨松质骨中的成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和骨形成的参数是无显著差异的，表明骨钙素缺乏并不影响骨量、骨密度、骨形成或骨吸收。分析两组小鼠的骨骼微结构发现，在野生型小鼠中羟基磷灰石晶体的c轴方向与胶原纤维的排列方向是平行的，而Ocn-/-小鼠中胶原纤维排列正常，但羟基磷灰石晶体c轴平行于骨纵轴的取向程度减弱，导致骨矿化紊乱，骨强度降低，表示骨钙素通过调整平行于胶原纤维的羟基磷灰石晶体c轴方向，影响骨骼矿化而影响骨质量和强度而不是数量。

对绝经后女性相关研究[4]发现，血清骨钙素水平与腰椎和髋关节骨密度呈显著负相关。印度的研究发现[5]，绝经后女性骨钙素水平显著升高；相较于骨密度正常的妇女，低骨量及骨质疏松妇女的血清骨钙素水平也是显著升高的。对绝经后使用激素替代治疗的妇女随访血清骨钙素水平，发现3个月内血清骨钙素水平较基线发生显著变化。在2型糖尿病患者中[6]发现，在男性和女性患者中，骨钙素水平升高与全腰椎、股骨以及髋关节骨密度下降均存在显著相关性。

血清骨钙素能直接反映成骨细胞活性，其水平与骨密度呈负相关，且血清骨钙素水平变化可作为评估骨质疏松治疗的早期疗效评价指标。

2 CXC趋化因子配体12

CXC趋化因子配体12(C-X-C chemokine ligand 12，CXCL12)属于CXC趋化因子家族，也被称为基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived D factor-1，SDF-1)，是一种由骨髓细胞中的基质细胞分泌的小信号蛋白，在成骨细胞系细胞、血管周围网状细胞等均有表达，与CXC趋化因子受体4(CXCR4)结合形成SDF-1/CXCR4轴，为细胞存活创造微环境。CXCL12影响间充质干细胞的迁移、生长、存活和分化，祖细胞通过CXCL12被募集到骨髓的壁龛形成成骨细胞和破骨细胞的前体细胞[7]。其促进破骨细胞前体细胞的趋化募集，募集后RANKL促进破骨细胞前体细胞成熟为破骨细胞[8]。同时CXCL12还通过调控基质金属蛋白酶间接影响破骨细胞前体从循环向骨髓的迁移[9]。

在动物实验中[10]发现CXCL12缺失小鼠股骨干中成骨细胞和破骨细胞特异性mRNA表达增加，加快了骨重建速度，但骨吸收和骨形成之间的平衡没有改变。研究同时发现CXCL12通过抑制成骨细胞的生成和成骨细胞系细胞提供的破骨细胞支持来抑制骨转换率。Pang等[11]发现，绝经后骨质疏松患者成骨细胞中CXCL12的mRNA和蛋白表达明显低于对照组，而破骨细胞中CXCL12的mRNA和蛋白水平明显升高，提示绝经后骨质疏松发生的机制可能是通过调控CXCL12基因表达抑制成骨细胞增殖和破骨细胞凋亡。Carbone等[12]对老年性骨质疏松患者的研究发现，CXCL12血浆浓度与髋关节骨密度呈负相关，但与髋部骨折发生率无显著相关性。表明在老年人中，血浆中CXCL12水平的升高与骨质疏松症的发生相关，但不能作为预测骨折风险的指标。Yang等[13]研究发现绝经后骨质疏松患者腰椎骨折组血浆CXCL12水平显著高于非骨折组，血浆CXCL12浓度与Genant半定量分级呈正相关。与绝经后非骨质疏松患者及对照组相比，绝经后骨质疏松患者股骨颈、全髋关节及腰椎的骨密度显著降低，且血浆CXCL12水平与股骨颈、全髋和腰椎骨密度呈显著负相关。血浆CXCL12水平升高也与视觉模拟评分(VAS)和Oswestry残疾指数评分(ODI)的严重程度相关。此外，CXCL12水平的升高也与炎症标志物TNF-α和骨吸收因子CTX-1呈正相关。这些研究发现血浆CXCL12水平与骨密度改变呈显著的相关性，且其升高的水平可反映骨质疏松的严重程度，可作为反映骨吸收的标志物。

3 凝溶胶蛋白

凝溶胶蛋白(Gelsolin，GSN)是钙依赖性的凝溶胶蛋白超家族的成员，通过切断、封端肌动蛋白丝，或使肌动蛋白聚集成核等方式来控制肌动蛋白的结构，作为肌动蛋白结合蛋白，参与破骨细胞胞足体的组装和移动过程，GSN缺陷可阻碍破骨细胞胞足体的组装，使骨质量和骨强度增加。此外，GSN可能通过整合素的激活将破骨细胞与骨基质联系起来，从而最终激活破骨细胞，促进骨吸收。

但是在不同的研究中，GSN与骨密度之间的联系并不是单一的。墨西哥的一项研究[14]发现在绝经后女性低骨量和骨质疏松患者中血清GSN水平降低但组间差异无统计学意义。外周血单核细胞(PBMs)作为破骨细胞的前体，产生对破骨细胞发育重要的细胞因子，在骨代谢中发挥重要作用。一项对极高值及极低值骨密度高加索男性的PBMs的细胞质蛋白组学分析[15]发现，极低骨密度患者GSN表达显著升高。同样一项对6 000多例样本采取极端采样法选取极高及极低骨密度样本进行研究发现，血浆GSN水平在男性极高和极低骨密度人群中无显著差异，但是在绝经后女性中GSN水平在极低骨密度组显著升高，与髋关节骨密度呈负相关[16]。两项对绝经后女性中GSN与骨密度的相关性研究发现[17-18]，较绝经前女性，绝经后女性GSN水平显著升高；较正常骨密度组比较，低骨量或骨质疏松组中血浆GSN水平显著升高，血浆GSN与绝经后女性髋部骨密度之间呈现负相关性，且GSN是股骨颈、腰椎骨密度的独立影响因素。目前研究表明血浆GSN或可作为诊断骨质疏松的骨吸收生化标志物，但仍需对其进行更深入和广泛的研究。

4 膜联蛋白A2

膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是一种表达在外周血单核细胞表面的钙依赖性的磷脂结合蛋白，能刺激单核细胞跨内皮细胞的迁移和破骨细胞的形成。然而，ANXA2在骨重塑中的作用并不局限于破骨形成，通过对ANXA2缺失的MC3T3-E1小鼠成骨前体细胞的功能实验[19]表明，ANXA2能够促成骨前体细胞的增殖和分化，从而影响骨形成。

在绝经后高加索女性中[20]发现ANXA2在低骨量和骨质疏松患者中表达增加。近期有研究发现[21]，相对于无骨折患者，骨质疏松性骨折患者的PBMs中ANXA2蛋白表达显著升高。血浆ANXA2蛋白水平与中国老年人髋关节骨密度呈负相关，并且在骨密度极低的人群中显著高于骨密度极高人群。同时研究观察到，ANXA2以浓度依赖性的方式调节成骨细胞的生长，较低浓度的ANXA2蛋白可促进成骨细胞的生长，但其促进成骨细胞生长的作用在较高浓度(>50 ng/mL)时减弱，ANXA2对成骨细胞生长的双重反向作用表明，血浆中ANXA2蛋白可能在体内骨形成与骨吸收的偶联和调节中发挥重要作用。

这些研究表明ANXA2可能是骨质疏松的潜在生化标志物，但是目前对于ANXA2的临床研究少，血浆中ANXA2水平能否预测骨质疏松还有待于进一步的纵向研究。

5 微小RNA

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类单链非编码RNA，长度约22个核苷酸，大多数miRNAs是高度保守的，miRNA对成骨细胞及破骨细胞的增殖和分化均有调控作用，miRNAs通过降低Runx2的稳定性和乙酰化水平、阻遏Wnt/β-catenin信号通路[22]等抑制成骨细胞的分化，削弱Hmga2对成骨细胞分化的抑制作用、抑制Smad7减轻Runx2的抑制作用、减轻c-Cbl对IP3K/ATK信号通路的拮抗作用等[23-25]促进成骨细胞的分化；miRNAs通过影响RANKL相关的因子表达抑制或促进破骨细胞的分化及功能[26]。

miRNAs在不同靶细胞中对骨质疏松发生发展的调控具有时序性和组织特异性。miR-29a通过结合RANKL的3’UTR抑制成骨细胞RANKL的分泌。抑制组蛋白乙酰转移酶(PCAF)介导的组蛋白3赖氨酸27(H3K27ac)乙酰化，降低H3K27ac在CXCL12启动子中的富集，从而减少破骨细胞分化。在骨钙素启动子驱动的成骨细胞中过表达miR-29a的小鼠比野生型小鼠表现出更高的骨密度、骨小梁体积和骨质量[27]。Liu等[28]发现与年轻患者相比，miR-96在老年患者的骨髓间充质干细胞中过度表达，使多种骨形成标志物表达下调，同时发现绝经后女性患者血清miR-96水平与血清骨碱性磷酸酶(SBALP)呈负相关。在大鼠和人类骨髓间充质干细胞(BMSC)的实验中发现miR-203的过表达通过直接靶向Dkk1mRNA增加了许多骨形成标志物表达，从而得出miR-203可以促进BMSC向成骨细胞分化；在临床试验中发现与正常受试者相比，骨质疏松妇女的miR-203水平显著降低[29-30]。使用RT-PCR检测骨质疏松患者和健康对照组之间的循环miRNAs。以人和小鼠成骨细胞系为研究对象，检测miRNAs的诱导差异。作者发现150个检测的miRNA中有14个在患者和健康对照之间显著异常表达。结果显示，骨质疏松患者miR-328-3p、let-7 g-5p、miR-133b、miR-22-3p、miR-2861、miR-518 miR-100表达下调，而miR-10b-5p、miR-21、miR-125b、miR-127表达上调。MiR-10b-5p增加人、小鼠成骨细胞ALP活性和矿物质沉积，促进成骨细胞分化。MiR-328-3p和let-7 g-5p降低ALP活性，抑制矿物质沉积[31]。

miRNA以被包裹在胞囊内或与相关蛋白质结合的方式被释放到细胞外液中称为循环miRNA，是非常稳定的物质，可以使用金标准技术(如定量聚合酶链反应)进行测量，使得miRNA有潜力成为新的诊断骨质疏松相关性疾病的生化标志物。

6 晚期糖基化终末产物受体

晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)属于免疫球蛋白超家族跨膜蛋白中的一员，被发现有内源性分泌(ES)和可溶性分泌(S)两种细胞外分泌形式，能够与多种内源性及外源性配体结合，在调节先天免疫应答中发挥重要作用。RAGE激活改变了骨细胞中大量下游信号通路，RAGE缺乏的破骨细胞整合素表达减少，抑制破骨细胞的成熟和粘附；在成骨细胞中，RAGE与配体结合激活增加了Raf/MEK/ERK信号转导，降低了细胞活力，激活了beclin1和lc3b介导的自噬[32]。

体外研究发现[33]，在RAGE缺失小鼠中分离的骨髓细胞中RANKL介导的破骨细胞分化/活性减弱，并且RAGE缺乏导致破骨细胞形态缺陷，这与破骨细胞分化减少以及骨吸收相关。这些破骨细胞缺陷是由于RAGE缺失骨髓源性巨噬细胞(BMMs)和破骨前细胞中αvβ3依赖信号通路的缺陷和肌动蛋白基细胞骨架组织的减弱。与野生型小鼠相比，RAGE缺乏小鼠骨密度、骨质量显著增加，破骨细胞数量减少[34]。RAGE缺乏小鼠的IL-6和吡啶啉水平显著降低而ALP水平无明显差异，提示RAGE缺乏可能主要影响破骨细胞功能，而不影响成骨细胞。去卵巢RAGE缺乏小鼠骨密度无显著变化，而对照组小鼠骨密度显著降低，表示RAGE缺乏小鼠的骨吸收受到抑制。RAGE缺乏导致破骨细胞形成和功能降低，骨密度、骨质量增加。

但是不同的研究发现sRAGE与骨密度的相关性是不一致的。对84名绝经后女性研究发现[35]，骨质疏松和低骨量患者血清sRAGE水平显著高于骨密度正常人群，且在骨质疏松和低骨量人群中，sRAGE水平与骨折风险增加存在相关性。但在老年男性中研究[36]发现esRAGE与骨形成标志物P1NP、骨钙素呈正相关，且这种相关性在患糖尿病的男性中更加显著。同时有研究表示[37]，绝经后女性2型糖尿病组与对照组sRAGE水平无显著差异，同时血清sRAGE水平与2型糖尿病组的骨密度、骨折患病率、骨转换标志物均没有显著的相关性。

RAGE被认为是刺激破骨细胞和成骨细胞分化和功能的信号事件的重要因素，低esRAGE水平已被报道为2型糖尿病患者椎体骨折的危险因素，其可能在监测骨质疏松进展方面具有潜在的诊断作用，但其在临床应用上的研究较少，需进一步深入研究其在预测骨折风险上的价值。

目前国际上仍以骨密度作为诊断骨质疏松的金标准，但随着对骨转换生化标志物的研究进展发现其能更早反映骨重建，且具有无创性、及时性等优点，越来越多的骨转换生化标志物已经应用于临床。对于新的骨转换标志物还需要更深入及广泛的研究其在临床应用上的特异性、灵敏性、稳定性等特征，使其能更好地应用于骨代谢疾病的诊断及鉴别诊断、药物开发以及骨质疏松症治疗疗效的临床监测。