环状核糖核酸在骨质疏松症中的研究进展

刘鑫 张亮 石鹏志 王平川 王俊武 张钰 胡满 赵文杰 王静成*

1.扬州大学临床医学院，江苏 扬州 225001 2.江苏省苏北人民医院，江苏 扬州 225001 3.大连医科大学，辽宁 大连 116044

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病[1]。OP已经成为我国中老年人群的重要健康问题，统计发现50岁以上男性OP患病率为6.0%，女性患病率则达到32.1%，65岁以上女性的OP患病率更是高达51.6%[2]。脆性骨折是OP的最常见临床并发症，常累及髋骨、股骨和脊柱等部位，导致疼痛、畸形、功能障碍甚至死亡。因此研究OP的发病机制及早期诊断标志物十分重要。

环状RNA(circRNAs)是一类在真核细胞中广泛存在并多样的内源性非编码RNA，通过将RNA的3’端连接到5’端形成环状结构，表达稳定，不易降解[3]。circRNsA的高丰度、稳定性和物种间的进化保守性赋予其许多潜在功能[4]。circRNAs具有多个miRNA的保守结合位点，能够竞争性结合内源性mRNA，作为分子海绵有效抑制其活性[3]。研究发现，大量哺乳动物细胞中均存在丰富且稳定表达的内源性circRNAs，而且有一些外显子circRNAs可充当miRNA海绵，并通过“mRNA陷阱”机制调节线性蛋白质编码RNA产物的表达[5]。越来越多的证据表明，circRNAs在细胞生长、信号转导和生理病理反应等多种生物学过程以及OP的诊治中发挥重要作用[6]。因此，本文就circRNAs在成骨及破骨分化中的miRNA海绵作用、成骨分化过程中和OP患者中circRNAs的表达谱、以及circRNAs作为OP潜在诊断生物标志物等方面进行综述，以期对OP诊治的发展有所帮助。

1 circRNAs的miRNA海绵作用

研究发现circRNAs含有多个miRNA反应元件(MREs)，在转录后水平通过发挥竞争性内源RNA(competing endogenous，ceRNA)的作用对靶基因进行调控，作为miRNA海绵来竞争性结合miRNA[7]。

1.1 circRNAs与成骨分化

在人脂肪源间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)成骨分化过程中，Shen等[8]研究发现circFOXP1和FOXP1的表达水平呈上升趋势，而miR-33a-5p的表达水平逐渐下降；circFOXP1过表达可以降低miR-33a-5p表达，增强FOXP1的mRNA表达，而circFOXP1敲除则导致相反结果；circFOXP1和miR-33a-5p的表达水平不受FOXP1调节；过表达circFOXP1或FOXP1的hASCs的碱性磷酸酶染色和活性均显著增强；并且茜素红染色和定量结果发现，过表达circFOXP1或FOXP1可以显著促进细胞外基质矿化。因此认为circ-FOXP1与miR-33a-5p结合后通过作用于FOXP1促进hASCs的成骨分化。

通过对绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者进行核糖核酸序列和生信分析，Yu等[9]研究发现PMOP中circRNA_0016624和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)表达明显下调。在人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)的成骨分化过程中，circRNA_0016624和BMP2表达升高，而miR-98表达降低。此外，过表达circRNA_0016624可以增加BMP-2表达，降低miR-98表达，而下调circRNA_0016624则表现出相反结果；进一步研究通过茜素红S染色法检测细胞分化程度，结果发现过表达circRNA_0016624可以明显促进成骨分化，这可能为OP的治疗提供新思路。

Xu等[10]研究发现在hBMSCs成骨分化过程中，circRNA_0011269和Runt相关转录因子2(RUNX2)表达升高，而miR-122表达降低；进一步研究发现过表达circ_0011269可以抑制miR-122表达，促进RUNX2表达，而沉默circ_0011269则获得相反结果；过表达miR-122可以抑制RUNX2表达，但对circ_0011269表达无明显影响；过表达circRNA_0011269可以显著上调成骨相关的生物标志物表达，而过表达miR-122则可以显著下调表达。Ji等[11]通过测序发现OP患者BMSCs中circ_0006215表达降低，过表达circ_0006215可以促进BMSCs向成骨细胞分化，增强成骨相关基因COL1A1、RUNX2和成骨细胞分泌蛋白表达；通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色定量分析发现，过表达或沉默circ_0006215可以显著促进或抑制BMSCs的成骨分化；通过RT-PCR分析发现，过表达或敲除circ_0006215则可以显著增加或降低BMSCs中circ_0006215表达；而circ_0006215可能是通过与miRNA-942-5p结合，从而调节BMSCs中RUNX2和血管内皮生长因子表达。由此说明成骨分化可与血管生成相偶联，因此，成骨-血管生成偶联可能成为今后OP病因及治疗研究的一个方向。另外，其他相关研究[2,12-22]也报道其他不同circRNAs可以作为miRNA的海绵通过其他信号通路调节成骨细胞分化(表1)。

表1 circRNAs在成骨分化中的miRNA海绵作用Table 1 miRNA sponge effect of circRNAs in osteogenic differentiation

1.2 circRNAs与破骨分化

circRNAs和miRNA在PMOP的发生和发展中发挥重要作用。通过RNA测序和生信分析等方法，Liu等[23]研究发现circ_0007059在PMOP患者和hBMSCs破骨分化过程中表达上调，而过表达circ_0007059可以抑制hBMSCs向破骨细胞分化；另外，破骨分化过程中BMP-2表达下调，circ_0007059可以靶向miR-378从而调控BMP-2表达；转染miR-378可以逆转circ_0007059对hBMSCs中破骨细胞分化的影响，而过表达circ_0007059可以通过miR378/BMP-2信号通路抑制破骨细胞形成。因此，靶向circ_0007059/miR-378/BMP-2轴可能是治疗OP的一个新靶点。

Liu等[24]研究发现，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导破骨细胞分化过程中circ_0000549表达下调，miR-1247-5p表达增加，破骨细胞特异性基因表达增加，过表达circ_0000549可以逆转这一作用；在破骨细胞和成骨细胞中过表达circ_0000549可以上调bcl6表达，沉默circ_0000549可以降低bcl6表达；此外，抑制miR-1247-5p可以明显增加bcl6表达；进一步研究发现miR-1247-5p可以促进TNF-α诱导的破骨细胞分化，而bcl6过表达则明显减弱miR-12475p的促进作用。因此，说明circ_0000549参与调节PMOP的成骨分化和破骨分化，为今后PMOP的机制研究提供了新的证据。

当然，调节破骨细胞分化的circRNAs不仅限于circ_0007059和circ_0000549，circRNA_28313和circRNA_0021739也参与其中。Chen等[25]研究发现体外敲除circRNA_28313后可以显著抑制RANKL及CSF-1诱导的BMSCs向破骨细胞分化，而在体内可以抑制去卵巢小鼠的骨吸收；通过检测未经处理和RANKAL及CSF-1处理的骨髓单核/巨噬细胞的circRNAs表达，并对破骨细胞分化过程中差异表达的miRNAs进行分析和鉴定。结果发现RANKL及CSF-1处理可诱导circRNA_28313表达，而miR-195a可以靶向circRNA_28313和CSF-1的3′非编码区，通过形成ceRNA网络调节骨髓单核/巨噬细胞的破骨细胞分化，并在破骨细胞分化中发挥作用，从而影响去卵巢小鼠的骨吸收。Guan等[26]研究发现，PMOP患者外周血单个核细胞中circRNA_0021739的高表达与破骨细胞miRNA-194-5p表达降低相关；过表达circ_0021739可以降低miRNA-502-5p表达水平，抑制破骨细胞分化。因此，miRNA-502-5p可能是circ_0021739调控破骨细胞分化的靶点。另外，其他相关研究[23-25,27]也报道了不同circRNAs可以作为miRNA的海绵来调节破骨细胞分化(表2)。

表2 circRNAs在破骨分化中的miRNA海绵作用Table 2 miRNA sponge effect of circRNAs in osteoclast differentiation

综上，circRNAs 主要通过作为 miRNA 的海绵调控细胞的成骨分化和破骨分化，从而在OP的发生和发展过程中发挥作用。

2 circRNAs的表达谱

2.1 成骨分化过程中circRNAs的表达谱

Zhang等[28]通过circRNA微阵列分析发现，hBMSCs分化过程中有3 938个circRNAs表达上调，1 505个circRNA表达下调；进一步通过生物信息学分析miRNA转录组，选择与miRNAs负相关、具有miRNA反应元件的circRNA构建circRNA-miRNA网络，结果发现在成骨细胞分化早期，差异表达的circRNAs的亲本基因在功能上参与局部粘附、ECM-受体相互作用及钙、胰岛素和mTOR信号通路。Qian等[29]通过RNA测序检测BMP-2诱导的小鼠胚胎成骨细胞成骨分化过程中circRNAs的差异表达，结果发现其中74个circRNAs表达显著上调，84个circRNAs表达显著下调；进一步研究发现差异表达的circ_19142和circ_5846不仅与正向调控发育的生物学过程密切相关，而且与参与细胞生长和分化的成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子和Wnt信号通路密切相关。Long等[30]通过circRNA微阵列分析小鼠脂肪基质细胞成骨分化过程中circRNAs的差异表达，结果发现其中453个circRNAs表达上调，629个circRNAs表达下调，而其中43个circRNAs(40个上调和3个下调)在成骨分化过程中的特定时间点持续变化。Li等[31]通过RNA测序分析hBMSCs成骨分化过程中的circRNAs差异表达，结果发现146个circRNAs差异表达，其中68个circRNAs表达下调，78个circRNAs表达上调。

因此，通过RNA测序或微阵列分析证实成骨分化过程中存在大量circRNAs差异表达，生物信息学分析差异表达的circRNAs可能为今后OP的机制研究提供重要线索。

2.2 骨质疏松症患者的circRNAs表达谱

通过RNA测序或微阵列分析技术可以对OP患者骨组织或血清样本中差异表达的circRNA进行检测和分析。Shen等[8]通过circRNA微阵列分析OP患者的骨组织，结果发现共有2 327个circRNAs表达下调，2 645个circRNAs表达上调；进一步选择其中差异表达最显著的circRNAs进行验证并预测相关miRNA，结果发现circRNAs通过与miRNA结合后作为miRNA的海绵发挥作用。Yu等[9]从OP患者的血清样本中提取总RNA后通过RNA测序分析，结果发现387个circRNAs差异表达，其中211个表达上调，176个表达下调。Yao等[32]对老年骨质疏松性椎体压缩性骨折患者外周血中的circRNAs进行RNA测序，鉴定出884个差异表达的circRNA，其中554个表达上调，330个表达下调；并通过进一步研究预测与这些差异表达的circRNAs相关的15条信号通路。Zhao等[33]通过circRNA微阵列分析发现PMOP患者有381个circRNAs差异表达，其中203个表达上调，178个表达下调。

综上，通过RNA测序及circRNA微阵列分析证实在成骨分化过程中和OP患者组织中存在差异表达的circRNAs，这为今后深入探索OP的机制提供重要参考依据。

3 circRNAs作为骨质疏松症潜在的诊断生物标志物

生物标志物作为可以标记系统、器官、组织、细胞及结构或功能的改变或可能发生改变的生化指标，在疾病诊断方面具有广泛用途。Han等[13]通过circRNA测序分析发现OP患者中circ_0076690表达明显下调，并与骨密度和T评分显著相关；并且ROC曲线分析发现circ_0076690的AUC值为0.829 9，灵敏度为79%，特异度为85%，因此认为circ_0076690可以作为OP潜在的诊断生物标志物。Guan等[26]通过RNA测序分析发现PMOP患者外周血单个核细胞中circ_0021739表达显著下调，其表达水平与股骨、前臂及腰椎的T评分正相关；进一步ROC曲线分析发现circ_0021739表达在PMOP有较高的诊断价值(AUC=0.849)，因此认为circ_0021739可能是一种潜在的PMOP诊断标志物。Zhao等[32]通过circRNA微阵列分析发现PMOP患者外周血单个核细胞中circ_0001275表达明显下调，进一步ROC曲线发现circ_0001275的AUC为0.759，因此认为circ_0001275可以作为POMP的潜在诊断生物标志物。除此之外，circRNA-0020 和circRNA-3832构成的ceRNA网络[34]、circ_0002060[35]及circ_0006859[18]也可以作为潜在的诊断生物标志物，这为OP的早期诊断和预防提供了新思路。

综上所述，circRNAs作为重要的调控因子，目前主要通过circRNAs-miRNAs-mRNAs 轴的ceRNA网络调控成骨分化及破骨分化等多个途径参与OP(表1、2)。目前涉及circRNA在OP发生发展机制方面的文献较少，研究方法主要集中在基因测序和生物信息学分析水平，对circRNA和miRNA相互作用的研究还比较欠缺。circRNA与miRNA、mRNA彼此相互作用，构成一个复杂的ceRNA调控网络参与基因表达，但circRNAs-miRNAs-mRNAs轴的具体机制还有待进一步研究。同样，研究circRNAs调控细胞的成骨分化和破骨分化在OP中的作用还处于初级阶段。因此，未来在这一领域的研究有助于深入了解骨代谢和OP的发生机制。此外，还需要进行大量的研究来揭示circRNAs在临床环境中开发治疗方法的潜力，除了常规的物理治疗和药物治疗外，如何从基因间的相互作用中寻找治疗OP的治疗方法。骨细胞在成骨分化中也有重要作用，circRNAs与骨细胞的生物功能是否相关尚不清楚，还需要深入探索。虽然目前circRNAs参与OP的具体机制尚不完全清楚，但随着科技发展和研究深入，未来OP的治疗方式有望得到进一步发展，从而为OP的治疗提供新思路和新靶点。