植物免疫诱抗剂对烤烟青枯病的诱导抗性及防控效果

韦学平， 苏江华， 罗 刚， 周文亮， 顾云峰， 王俊锋

(广西壮族自治区烟草公司 百色市公司， 广西 百色 533000)

0 引言

【研究意义】烟草青枯病俗称烟瘟、半边疯，是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性维管束病害，该病属于典型的土传病害。病菌主要从根部侵入木质部维管束组织并大量繁殖，发病后，易造成全株萎蔫和死亡，对烟草的产量和质量影响很大，是烟草生产过程中的主要限制因子之一[1-4]。烟草青枯病的有效防控十分困难，采用杀菌剂防治青枯病的效果尚不十分理想，生物防治效果不够稳定，而农业防治措施不易实施到位。因此，寻求有效的烟草青枯病防治措施一直受到研究者的关注。植物系统获得抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)是指利用物理、化学或者生物因子，诱导植物抗性基因的表达，促使防卫反应产物积累，从而提高自身抗病能力。在此诱导过程中，涉及一系列防卫反应相关酶及基因的激活、信号传输及植物组织抗病相关生理生化的变化[5]。开展诱导烟草主动产生抵御病虫害的抗性能力及其他抗逆能力，提高产量及品质的研究，是促进烟草生产可持续发展的新起点和防治烟草病害的新思路。【前人研究进展】关于植物诱导抗病性的研究工作始于20世纪50年代，因其具有抗性持久稳定、广谱、无污染等特点，使得开发诱抗剂成为目前有害生物绿色防控技术研究的热点之一。已有研究报道表明[6-10]，水杨酸(Salicylic acid，SA)、苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)、β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid，BABA)、2,6-二氯异烟酸(2,6-dichloroisonicotinic acid，INA)、噻菌林(Probenazole，PBZ)及茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等可诱导烟草对多种病原物产生抗性，且某些化学诱抗剂已用于烟叶生产。一些非致病菌或从生物体提取的物质，如壳聚糖(Chitosan)、寡糖素(Oligosaccharin)、糖蛋白(Glycoprotein)和Harpin类蛋白，会引发组织内多种防御性酶的活性提高，从而诱导产生抗病性[11]。陈泽鹏等[12]研究表明，苯并噻二唑(BTH)对烟草诱导抗病具有显著效果，浓度50 μg/mL处理，离体和活体诱导抗病率分别为60.96%和52.76%。赵小明等[13]利用氨基寡糖素防治烟草、辣椒及番茄等作物病毒病，其对烟草病毒病的防效达77.9%。王志愿[14]研究发现，诱抗剂壳聚糖(CTS)对烟草青枯病的防控效果达81.17%。韩松庭等[15]研究发现，2,6-二氯异烟酸与多粘类芽孢杆菌联用对青枯病的防控效果达50%以上，显著高于其他处理。【研究切入点】目前，防治烟草青枯病的主要办法有化学防治、生物防治、农业防治和选用抗病品种等，但仍以化学防治为主。而化学药剂不仅易使青枯病菌产生耐药性，对土壤和水体等均有严重危害。因此，具有无污染、不易产生抗性、对人畜安全等优点的生物防治已成为防治青枯病的研究热点。植物诱导抗病性具有广谱、抗性持久且稳定、无污染等特点，利用植物天然免疫系统防治病虫害，可减少农药的使用，降低农残，提高产品安全性，更符合当今烟草绿色防控发展理念的要求。【拟解决的关键问题】对不同来源的植物免疫诱抗剂噻菌铜、多肽保、绿色木霉菌、青枯立克、奇农素、氨基酸酶及乙蒜素等20种诱抗剂及其不同组合开展抗性测定，筛选对烟草青枯病有显著防治效果的诱抗剂及组合，以期为烟草病害绿色防控提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 烟草青枯病病原菌从采自广西靖西市的烟草青枯病标本中分离获得。

1.1.2 烤烟 供试烟草品种为云烟87，由云南省烟草农业科学研究院提供。

1.1.3 试剂 NA培养基(琼脂粉15 g，蔗糖15 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，蒸馏水1 000 mL)，自制；水杨酸、茉莉酸、苯丙咪二唑类、苯并噻重氮、苯并噻唑、2,6-二氯异烟酸、氨基酸酶、多肽保、绿色木霉、噻菌铜、奇农素、壳聚糖、过敏素蛋白、青枯立克、黄腐酸、腐殖酸、乙蒜素、寡糖素、天冬氨酸及有机硅(市购)。

1.1.4 仪器设备 SP-754紫外分光光度计(上海Thermo有限公司)，台式高速冷冻离心机(BecKman公司)，BS 223S型精密电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(JULABO德国)及250D光照培养箱(常州国华电器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 烟草青枯病病原菌的分离培养 使用平板划线分离法进行病原菌分离。将标本病茎用清水冲洗干净，纵剖，切取褐变的维管束组织，用75%酒精表面消毒30 s，0.1%升汞溶液消毒1 min，之后用无菌水漂洗3次。磨碎组织加无菌水稀释，用灭菌移植环沾取含菌液体在NA培养基上划线培养。之后挑取青枯菌的单菌落，加无菌水稀释，转接于NA培养基上纯化培养，最后移入灭菌水中保存备用。

1.2.2 诱抗剂对烟草青枯病的防控 云烟87采用盘栽，移栽时间为3月15日，移栽当天第1次施药，之后每10 d施用1次，每次施200 mL，共施用3次。每个处理50株烟，3次重复，小区随机排列。在第1次施药后7 d，采用伤根接种青枯病原菌。第3次施用后15 d调查病情指数，每处理调查50株，计算防治效果。

1) 单一诱抗剂。试验设21个处理，分别按水杨酸、茉莉酸、苯丙咪二唑类、苯并噻重氮、苯并噻唑、2,6-二氯异烟酸、氨基酸酶、多肽保、绿色木霉菌、噻菌铜、奇农素、壳聚糖、过敏素蛋白、青枯立克、黄腐酸、腐殖酸、乙蒜素、寡糖素、天冬氨酸及有机硅的常规使用浓度进行试验，以清水作对照(CK)。

2) 不同诱抗剂组合。试验设6个处理：T1，氨基酸酶(500倍)；T2，多肽保(60倍)+绿色木霉菌(6 000倍)；T3，氨基酸酶(500倍)+噻菌铜(500倍)+奇农素(750倍喷湿叶面)；T4，氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+绿色木霉菌(6 000倍)；T5，氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+青枯立克(500倍)+乙蒜素(500倍)；T6，对照(CK)，常规施肥。

1.2.3 诱抗剂对烟草抗青枯病的诱导 按诱抗剂对青枯病防控的组合处理(T1～T6)进行试验，常规管理。灌根处理，每次施200 mL，每小区200株，3次重复。在施药后7 d，采用伤根接种青枯病原菌，分别于CK明显发病后1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d及14 d，参考贾春燕[16]的方法进行粗酶液的提取和SOD、POD及CAT活性测定。

1.2.4 田间诱导抗病试验 按诱抗剂对青枯病防控的组合处理(T1～T6)试验进行，常规施肥。试验于2017—2018年在广西壮族自治区靖西市新甲乡新荣村长期种植烟草的田块进行大田试验，云烟87移栽时间为2月25日，试验地泥土为壤土，周边大山环绕，烟草青枯病常年大面积发生。移栽当天第1次施药，之后每10 d施1次，共施3次，每次施200 mL。3次重复，小区面积130 m2，小区随机排列。于5月15日进行病情调查，每处理调查100株。烟草病害严重度分级标准采用烟草病虫害分级及调查方法：GB/T 23222—2008[17]进行分级，计算诱抗效果。

病情指数=∑[(各级病株数×级数值)/(调查总株数×最高级数值)]×100

防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%

1.3 数据统计与分析

通过Excel 2010录入数据并作图，使用SPSS的Duncan法检测及进行差异显著性检验分析。

2 结果与分析

2.1 不同诱抗剂对烟草青枯病的室内诱导抗性

2.1.1 单剂 从表1看出，第3次施药后15 d，噻菌铜、多肽保、绿色木霉菌、青枯立克及奇农素等20种诱抗剂对烟草青枯病均有不同程度的抑制作用，各诱抗剂处理的病情指数为19.56～35.33，均低于CK(37.33)；防治效果为5.36%～47.02%，其中，噻菌铜、多肽保、绿色木霉菌、青枯立克、奇农素、氨基酸酶和乙蒜素的防治效果相对其余药剂较好，使用后烤烟青枯病病情指数明显下降，均低于23.00，对烟草青枯病防治效果分别为47.02%、45.83%、44.64%、43.45%、41.67%、39.88%和39.29%。表明，7种诱抗剂对烟草青枯病的发生均具有一定的防治效果，后续进一步对7种诱抗剂进行不同组合抗性测定。

表1 不同诱抗剂处理后烟草青枯病的病情指数及防治效果

2.1.2 组合剂 从表2看出，诱抗剂处理烟草青枯病的病情指数为11.11～18.67，防治效果为42.86%～65.99%，不同药剂组合处理均较氨基酸酶(单剂)和CK有不同程度提高。其中，T2、T4和T5对烟草青枯病防治效果较好，其病情指数相对较低，依次为16.67、13.33和11.11，防效分别为48.98%、59.18%和65.99%。

表2 不同处理烟草青枯病的病情指数及防治效果

2.2 不同处理烟草叶片的酶活性

从图1看出6个处理烟草叶片的SOD、POD及CAT活性变化。

图1 不同处理烟草叶片的SOD、POD及CAT活性

2.2.1 SOD活性 6个处理各时段烟草叶片的SOD活性均呈T5>T4>T2>T1>T3>T6(CK)，且随时间延长，各处理SOD活性基本呈上升趋势，第10天达峰值，而后开始平稳下降。其中，T5的SOD活性在各时段均最高，T4其次，T2第3，表明3个处理的诱导抗性较好。

2.2.2 POD活性 6个处理各时段烟草叶片的POD活性均呈T5>T4>B>T1>T3>T6(CK)，且随时间延长，均发生明显变化，呈先升后降趋势，均在第10天达峰值。其中，T5的POD活性在各时段均最高，T4其次，T2第3，表明3个处理在受到病原菌侵染时均可诱导烟草提高对青枯病的抗性；T1和T3的烟叶POD活性变化较平稳，不具有明显的诱导效果，但也略高于T6(CK)。

2.2.3 CAT活性 6个处理各时段烟草叶片的CAT活性均呈T5>T4>T2>T1>T3>T6(CK)，且随时间延长，T5、T4和T2均发生明显变化，呈先升后降再升趋势。其中，T5、T4和T2烟叶的CAT活性明显高于T3、T1和T6，各处理CAT活性在第8天达高峰，T5的CAT活性变化最大，T6的变化最小。表明，T5、T4和T2均可诱导烟草提高对青枯病的抗性。

2.3 田间防治效果

从表3看出，2017年和2018年6个处理烟草的发病率、病情指数及防治效果变化。

表3 不同处理对烟草青枯病的田间防治效果

2.3.1 发病率 2017年和2018年诱抗剂处理烟草田间青枯病的发病率分别为5%～11%和6%～12%，均低于CK(12%和14%)，均表现为T5

2.3.2 病情指数 2017年和2018年诱抗剂处理烟草田间青枯病的病情指数分别为4.67～9.56和6.67～10.00，2年均低于CK(13.78和15.78)，均表现为T5

2.3.3 防治效果 2017年和2018年诱抗剂处理烟草田间青枯病的防治效果分别为30.65%～66.13%和36.62%～57.75%，2年试验结果基本一致，表现为T5>T4>T2>T1>T3。T4和T5对烟草青枯病的防治效果较好，2017年、2018年分别达56.45%、66.13%和49.30%、57.75%。T3对烟草青枯病的防治效果不理想。

3 讨论

植物抗性诱导物质作为一种新型的生物制剂，不仅能有效防治病虫害，还能提高作物产量，对植物的抗逆功能也有提高作用，因此在烟草病害的综合防治中越来越受到重视。黄夸克等[18]研究报道，大田期使用诱导抗病剂“多肽保”后，对烟草黑胫病的相对防治效果平均达75.0%，对烟草根黑腐病的相对防治效果平均达75.9%。何永福等[19]发现，多肽保能够显著提高反季节白菜的产量，并对霜霉病有一定的防治效果。端永明等[20]研究报道，烟草大田期喷施2.50 g/L绿色木霉菌对黑胫病的最高防效为81.3%，对野火病的最高防效为80.0%。韦文添[21]研究报道，80%乙蒜素对油梨炭疽病菌有很好的防治效果。研究结果表明，噻菌铜、多肽保、绿色木霉菌、青枯立克和奇农素等20种诱抗剂对烟草青枯病均有一定的抑制作用，其中，噻菌铜、多肽保、绿色木霉菌、青枯立克、奇农素、氨基酸酶和乙蒜素的作用较好，使用后烤烟青枯病病情指数明显下降，对烟草青枯病防治效果分别为47.02%、45.83%、44.64%、43.45%、41.67%、39.88%和39.29%。以上几种诱抗剂对烟草青枯病的发生均具有一定的防治效果。氨基酸酶(T1)、多肽保+绿色木霉菌(T2)、氨基酸酶+噻菌铜+奇农素(T3)、氨基酸酶+多肽保+绿色木霉菌(T4)和氨基酸酶+多肽保+青枯立克+乙蒜素(T5)等不同组合处理对烟草青枯病有明显防治效果。2017年和2018年各组合处理对烟草青枯病的田间防治效果基本一致，均表现为T5>T4>T2>T1>T3。T5和T4对烟草青枯病的防治效果比较好，2017年和2018年分别达56.45%、66.13%和49.30%、57.75%。氨基酸酶、多肽保、绿色木霉菌、青枯立克等诱抗剂及其不同组合对诱导烟草提高抗病性具有较好的效果。研究结果表明，氨基酸酶、多肽保、绿色木霉菌、乙蒜素等诱抗剂及不同组合对烟草等作物有较好的防治效果，与刘太国等[6-7,12]的研究结果基本一致。

4 结论

氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+绿色木霉菌(6 000倍)和氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+青枯立克(500倍)+乙蒜素(500倍)处理能较好地诱导烟草抗青枯病，防治效果明显，可作为烟区防治烟草青枯病的新方法。