济生肾气汤加三七、鳖甲对CCl4 诱导肝纤维化大鼠模型的干预作用及机制

钟镇康，周晓玲，王月明，吴 腾，陆世银，沈新辉

（1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.柳州市中医医院，广西 柳州 545001）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是一种可由多类病因引起的细胞外基质在肝组织中过度积累导致肝组织结构及功能发生异常的病理变化，是众多慢性肝病的共同病理改变，也是发展至肝硬化的必经过程，其实质是一种可逆的肝组织损伤的过度修复［1-5］。目前肝纤维化的西医治疗方式主要以祛除病因及对症治疗为主，但由于其发病机制复杂，涉及多个细胞、细胞因子、蛋白及信号通路等，单一靶标干预往往疗效欠佳，例如使用核苷类似物抗病毒治疗，即便已获得满意的病毒学效应，肝脏炎症得到有效改善，却仍然有一部分患者不能完全逆转肝纤维化，且病情仍可呈进行性发展［6］，对于病因尚不明确的肝纤维化治疗显得更为棘手，肝纤维化如进展至肝硬化失代偿期或肝癌等将严重威胁患者生命健康［7］，故在病因治疗的基础上，积极有效地抗肝纤维化是阻断疾病进展不可或缺的环节［8］。

中医药治疗具有多靶点、多层次、整体调控作用及不良反应相对较少的优势特点而成为抗肝纤维化药物研究的热点［9-11］。笔者所在团队前期实验研究中表明了济生肾气汤可促进移植后干细胞向肝脏归巢，从而发挥治疗肝硬化作用［12］，在临床研究中也证实了此方联合干细胞治疗可降低肝硬化患者的临床症状积分，改善患者肝功能及肝纤维化指标［13］。在前期研究成果的基础上，笔者发现采用济生肾气汤加上具有活血化瘀消癥散结功效的三七与鳖甲具有显著的抗肝纤维化作用，但具体作用机制尚未明确，故本研究建立CCI4诱导的肝纤维化大鼠模型，予中药灌胃治疗，检测相关指标，观察治疗后肝纤维化大鼠肝组织病理形态学变化，探讨其具体干预通路，从而为济生肾气汤加三七、鳖甲抗肝纤维化提供更多科学理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF 级雌雄各半SD 大鼠54 只，3~4 周龄，体质量（140±10）g，购于长沙市天勤生物技术有限公司。实验动物使用许可证号：SCXK（湘）2019-0014。所有大鼠置养于柳州市中医医院动物实验室，室温保持在20~25 ℃，湿度保持在50%~65%，处于自然光照，予普通饲料及正常饮水适应性饲养1 周。实验大鼠的饲养及实验过程遵循了国家实验动物管理条例。

1.2 药物

济生肾气汤加三七、鳖甲（熟地黄40 g、山茱萸20 g、山药20 g、泽泻15 g、茯苓15 g、丹皮15 g、肉桂5 g、附子5 g、车前子10 g、牛膝10 g、三七3 g、鳖甲15 g）。以上药物为农本方颗粒制剂，由培力（南宁）药业有限公司生产，将以上药物颗粒制剂加入纯水配制成1.56、3.11、6.22 g/mL 的低、中、高浓度中药混悬液，放置4℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

试剂：果尔特级初榨橄榄油（西班牙，GB/T23347）；CCl4（天津市富宇精细化工有限公司，GB/T688-2011）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、Masson 三色染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，批号分别为：G1337、G1080、G1100）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号分别为C009-2-1、 C010-2-1。 Rat （TGF-β、 Ang-Ⅱ 、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α）ELISA Kit 购自武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号：RA20599、RA20075、RA20662、RA20020、RA20607、RA20035；RNA 提取试剂盒Trizol（Invitrogen，批号：15596026），购自赛默飞世尔科技有限公司。MonScript RTllI All-in One Mix with dsDNase、MonAmp SYBR Green qPCR Mix（莫纳生物科技有限公司，批号：MR05101、MQ10101）。主要仪器：高速冷冻离心机（长沙湘锐离心机有限公司，TGD-20MC），超速低温离心机（美国Sigma 公司），光学显微镜Olympus-BH2（日本Olympus 公司），全自动生化分析仪（日本日立7170S），全波长酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司，型号：1510），核酸蛋白定量检测仪（美国Eppendorf公司，型号：6133），S1000TMTHermal Cycler 基因扩增仪（美国BIO RAD 公司），7500 Real PCR System（美国ABI 公司，型号：4345241）。

1.4 方法

1.4.1 分组与造模 将适应性饲养1 周后的大鼠随机取出10 只作为对照组，其余44 只大鼠采用腹腔注射40%CCl4橄榄油溶液（CCl4与橄榄油体积按2∶3 配备），每周2 次，持续8 周的方法制作肝纤维化大鼠模型。造模结束后随机取4 只大鼠进行肝组织活检，如出现肝细胞坏死，炎症细胞浸润，胶原纤维形成，肝组织正常结构被破坏，提示肝纤维化模型制作成功。将造模成功后的大鼠40 只随机分为模型组、中药治疗（低、中、高浓度）组，每组10 只。

1.4.2 给药 药物剂量根据人与大鼠体表面积换算法计算，药物溶液体积按1 mL/100 g 给予，中药治疗（低、中、高浓度）组分别予济生肾气汤加三七、鳖甲混悬液15.6、31.1、62.2 g/kg 灌胃。对照组及模型组均予等体积蒸馏水灌胃。每天给药1 次，共4周。灌胃期间不限制大鼠饮食及饮水。

1.4.3 采集标本 灌胃结束后，隔夜禁食12 h，不限饮水，予10%水合氯醛，按0.5 mL/100 g 剂量予腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血后静置1 h，用离心机3 000 r/min 离心10 min，获得上层血清，−80℃保存备用。采血结束后，迅速取出肝脏，采集0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 组织标本，一部分予液氮速冻后置于−90℃冰箱保存，用于RT-PCR 检测；一部分用10%甲醛固定后，自动脱水机逐级脱水，浸蜡包埋，作0.3 μm 厚度切片，用于染色后肝组织病理形态学的观察。

1.4.4 肝组织病理形态学观察 将“1.4.3”所得的各组大鼠肝组织切片分别行HE、Masson 染色，在光学显微镜下观察肝组织炎症及胶原纤维沉积情况。1.4.5 肝功能检测 将“1.4.3”所采集的血清采用全自动生化分析仪检测各组大鼠ALT、AST 含量。

1.4.6 TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α含量测定 采用ELISA 法，将“1.4.3”所采集的血清按试剂盒说明书步骤严格进行操作，运用酶标仪在450 nm 吸光处读取OD450值并计算TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α 含量。

1.4.7 Col-Ⅰ mRNA、Col-Ⅲ mRNA、TGF-β mRNA 表达水平测定 采用RT-PCR 法测定，取“1.4.3”中肝组织30 mg，Trizol 一步法提取总RNA。紫外分光光度计测定所总RNA 浓度，用逆转录试剂盒将RNA 逆转成cDNA，随后以cDNA 为模板进行扩增。qPCR 反应体系：SYBR Green qpcr Mix 10 μL，正 反 向 引 物 个 各0.4 μL，cDNA 2 μL，Nuclease-Free Water 7.2 μL。反应条件：采用三步法，预变性95 ℃、30 s，变性95 ℃、10 s，退火55～65 ℃、10 s，延伸72 ℃、30 s，共41 个循环。以β-actin为 内 参 基 因，采 用2-△△Ct法 计 算Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表 达 水 平。根 据Genebank 已 知 序 列 进 行Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 引物设计，引物由擎科生物技术有限公司合成。引物序列号如表1。

表1 各基因引物序列Tab 1 Primer sequences of each gene

1.5 统计学处理

采用SPSS 24.0 软件进行数据统计分析，作图使用GraphPad Prism 5，计量资料以（±s）表示，多个样本间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD-t检验，若方差不齐则采用非参数检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCl4致肝纤维化大鼠肝功能的影响

与对照组相比，模型组大鼠ALT、AST 水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示造模成功；与模型组对比，中药各组ALT、AST 水平均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），其中以中药高剂量组效果最为明显。见表2。

表2 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠肝功能指标的影响（U/L，n=10，±s）Tab 2 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on liver function（ALT and AST）of rats with CCI4-induced liver fibrosis（U/L，n=10，±s）

表2 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠肝功能指标的影响（U/L，n=10，±s）Tab 2 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on liver function（ALT and AST）of rats with CCI4-induced liver fibrosis（U/L，n=10，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。

组别对照组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组AST 13.28±4.57 69.54±12.26**55.72±12.29##49.24±13.28##27.73±11.62##39.844 P＜0.01 FP ALT 21.72±7.21 139.00±20.21**108.36±18.83##92.35±22.80##53.08±20.62##60.448 P＜0.01

2.2 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织病理形态学的影响

大鼠经腹腔注射40%CCL 48 周后，肝组织病理切片HE、Masson 染色结果见图1、2。图1A 及图2A 显示：对照组肝小叶结构正常，肝细胞索以中央静脉呈放射状均匀紧密排列，肝组织未见炎症及纤维化改变。与对照组相比，图1B 及图2B 显示：模型组大部分肝细胞发生明显变性坏死，肝细胞排列紊乱，坏死的肝细胞形成纤维间隔将肝实质分成大小不一的肝细胞团，形成假小叶，提示造模成功。与模型组相比，图1（C、D、E）及图2（C、D、E）显示中药低、中、高剂量组大鼠炎症及纤维化程度均有不同水平减轻。

图1 肝组织HE 染色（×10）Fig 1 HE staining of liver tissue（×10）

图2 肝组织Masson 染色（×10）Fig 2 Masson staining of liver tissue（×10）

2.3 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCl4致肝纤维化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1的影响

与对照组相比，模型组肝纤维化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示造模成功。与模型组相比，中药各剂量组IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、CHI3L1 水 平 均 有 明 显 下 降，差 异具有统计学意义（P＜0.05），其中以中药中、高剂量组干预效果最为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）；对于Ang-Ⅱ而言，中药中、高剂量组Ang-Ⅱ水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01），而中药低剂量组治疗效果不明显（P＞0.05）。见表3、4。

表3 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 的影响（n=10，±s）Tab 3 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and trionyx sinensis on serum IL-1，IL-6 and TNF-α in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表3 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 的影响（n=10，±s）Tab 3 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and trionyx sinensis on serum IL-1，IL-6 and TNF-α in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

TNF-α组别IL-1 IL-6 29.49±3.88 107.25±13.76**94.64±14.81#79.27±13.55##68.89±17.77##48.004 P＜0.01对照组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组FP 53.51±6.50 111.45±20.18**98.82±14.77#84.97±12.58##78.48±9.96##25.977 P＜0.01 75.69±11.10 129.62±19.12**114.90±14.71#104.16±12.58##89.59±15.45##20.145 P＜0.01

表4 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠血清TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 的影响（n=10，±s）Tab 4 Effects of Jisheng Shenqi Decoction on serum TGF-β，Ang-Ⅱand CHI3L1 in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表4 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠血清TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 的影响（n=10，±s）Tab 4 Effects of Jisheng Shenqi Decoction on serum TGF-β，Ang-Ⅱand CHI3L1 in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

CHI3L1 97.10±10.41 418.90±46.80**334.50±57.33#312.80±59.59##259.20±50.94##60.854 P＜0.01组别对照组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组FP TGF-β 92.16±15.52 229.69±26.43**206.07±29.50#190.01±24.98##171.24±21.26##47.711 P＜0.01 Ang-Ⅱ19.13±2.34 178.34±21.43**171.61±22.01 141.36±19.75##125.96±25.10##104.511 P＜0.01

2.4 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCl4致肝纤维化大鼠 肝 组 织Col-ⅠmRNA、Col-Ⅲ mRNA、TGF-β mRNA 表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠肝组织中Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，中 药 中、高 剂 量 组Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表达均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；除TGF-β mRNA 外，中药低剂量组中Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA 表达也有不同程度降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠肝组织Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表达的影响（n=10，±s）Tab 5 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on the expression of Col-ⅠmRNA，Col-ⅢmRNA and TGF-β mRNA in liver tissue of rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表5 济生肾气汤加三七、鳖甲对CCI4致肝纤维化大鼠肝组织Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表达的影响（n=10，±s）Tab 5 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on the expression of Col-ⅠmRNA，Col-ⅢmRNA and TGF-β mRNA in liver tissue of rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别Col-ⅠmRNA Col-ⅢmRNA TGF-β mRNA 1.014±0.119 2.491±0.204**2.331±0.280 2.140±0.203##2.088±0.217##74.846 P＜0.01对照组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组FP 0.989±0.229 2.992±0.291**2.697±0.376#2.596±0.392##2.127±0.312##58.073 P＜0.01 0.922±0.146 1.975±0.223**1.756±0.2871#1.668±0.249##1.516±0.273##27.081 P＜0.01

3 讨论

肝纤维化根据其病理特点及临床表现，隶属于中医学“胁痛”、“积聚”、“臌胀”等范畴。《医宗必读》曰：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”，《内经》曰：“温气不行，凝血蕴里而不散”，肝纤维化为慢性疾病，病程漫长，久病入络，此病基本病机应为虚损生积、正虚血瘀［10］，治疗总则应以补虚扶正，活血化瘀消积为主。仲景提出“血不利则为水”一说，“血不利”主要体现在瘀血状态，“水不利”主要体现在水液停聚，此论述内涵体现在血与水生理上同源互化，病理上互为因果，交结为患的密切关系。《血证论》：“水病而累血，血病而兼水”、“瘀血化水，亦是血瘀而兼水也”，由此可知，治瘀血亦可从利水调气入手。济生肾气汤出自宋代医家严用和《济生方》，由仲景金匮肾气丸中桂枝改为肉桂，干地黄改为熟地黄，加车前子、牛膝组合而成，此方具有温阳化气，利水消肿之功，主治肾虚腰重水肿，小便不利。此方内寓三补三泻之法，三补以滋补肾阴为主，有“补肾生髓以生肝”之意，大剂滋阴之药中少佐桂附之品，意在少火生气，阳得阴助则生化无穷，温肾补阳化气以助活血利水，“三泻”则为泽泻、车前子、茯苓等渗泄水湿，调节气机，唐容川：“治气即是治水，治水亦即治气”、“治血者必调气”，故予本方温补阳气、益火之源，以施化气利水，调畅三焦气机之效，气机疏畅，血脉自通，加三七、鳖甲既可消癥散结，又化瘀不伤正，全方共奏温阳活血利水，化瘀消癥散结之功。

ALT、AST 在肝脏中含量最多，主要存在于肝细胞质内，是反映肝细胞损伤的灵敏指标，本研究结果显示，相比对照组而言，模型组大鼠在肝细胞发生损伤坏死形成肝纤维化时，ALT、AST 在血清中显著升高（P＜0.01），予济生肾气汤加三七、鳖甲干预后，ALT、AST 显著降低（P＜0.01），表明济生肾气汤加三七、鳖甲可以发挥保护肝细胞的作用。肝组织病理活检为诊断肝纤维化的金标准［14］，因其属于有创操作，具有潜在感染、出血、可重复性差、操作误差等特点而未能广泛用于临床，肝脏瞬时弹性成像技术也可因胆汁淤积、肝脏炎症、脂肪变性及进食等方面而存在一定的检测误差，同样传统肝纤4 项检查结果往往也容易受肝脏炎症的影响［10］。壳多糖酶3 样蛋白1（CHI3L1），又称几丁质酶3 样蛋白1，是一种与多种肝脏疾病密切相关的新型血清学标志物，其在肝脏中表达最为丰富，具有高度特异性［15-18］。CHI3L1 与肝纤维化程度呈正相关，参与肝纤维化的形成主要通过炎症反应、细胞增殖分化，抗细胞凋亡及促进细胞外基质重塑等病理过程［19，20］。在评估肝纤维化程度评估方面，CHI3L1 优于透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PⅢNP）、层黏连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（CⅣ），拥有较高的肝纤维化诊断价值［21-24］。因此，测量CHI3L1 对于评估肝纤维化疗效有一定指导意义。本研究结果显示，中药各剂量组CHI3L1 水平显著降低，表明济生肾气汤加三七、鳖甲可有效改善肝纤维化。继发于肝细胞变性坏死的肝细胞再生及纤维组织增生进一步导致血管新生、血栓形成，加重肝细胞损伤及肝脏血液循环障碍［25］，肝窦血管病变及细胞外基质在肝脏中过度沉积表现符合中医“瘀血”本质特点［10］，本方所加三七、鳖甲两者合用具有活血化瘀、软坚散结之效，两者可通过抑制HSC 活化、促进细胞外基质降解等多种途径发挥显著抗肝纤维化作用［26-29］。

研究表明，人体肝脏中也存在肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS），RASS 可参与肝纤维化的发生发展［30］，其中ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 轴是促进肝纤维化形成的重要传导通路，当肝脏受损时，RASS中如Ang-Ⅱ、AT1R 等成分会上调或重新分布，例如在肝纤维化时，Ang-Ⅱ含量明显增多［31］，且与肝纤维化程度呈正相关。ACE 将Ang-Ⅰ裂解成Ang-Ⅱ，Ang-Ⅱ作为RASS 中最重要的活性物质之一，具有显著的促炎及促纤维化作用，既参与炎症反应，又 能激活HSC 促进TGF-β、TNF-α、IL 等细胞因子释放［32，33］，上述细胞因子反过来又可持续刺激HSC 增 殖活化并增 加ECM 的生成［34-40］，HSC 活化作为肝纤维化形成的中心环节，HSC 大量增殖，发生表型转变分化为肌成纤维细胞，分泌ECM，ECM 生成过多，降解相对较少，在肝组织中过度沉积而导致肝纤维化形成。此外，Ang-Ⅱ还可通过AT1R 激活HSC，上调Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β mRNA的表达［41，42］。有 研究表明，通过使 用AT1R 拮抗药或ACE 抑 制 剂 可 发 挥 抑 制 肝 纤 维 化 作 用［30，43］。TGF-β 是调节ECM 生成与沉积最重要的细胞因子之一，其可促使HSC 活化，并能促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达，具有明显的促肝纤维化作用［44，45］。本研究结果显示，与对照组比较，模型组肝纤维化大鼠血 清 中 的Ang-Ⅱ、TGF-β、IL-1、IL-6、TNF-α 水 平均显著升高（P＜0.01），经予济生肾气汤加三七、鳖甲干预后，Ang-Ⅱ、TGF-β、IL-1、IL-6、TNF-α 水平均发生降低，表明济生肾气汤加三七、鳖甲可作用于ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 轴，降 低Ang-Ⅱ、TGF-β 含量，进而减少IL-1、IL-6、TNF-α 等相关细胞因子的生成。Ⅰ、Ⅲ型胶原作为ECM 主要成分参与肝脏纤维组织结构的形成，本研究结果显示，与对照组比较，模型组肝纤维化大鼠肝组织中的Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表达明显上升（P＜0.01），经予济生肾气汤加三七、鳖甲干预后，以上基因表达均有不同程度水平下降，表明济生肾气汤加三七、鳖甲可调节ECM 生成与降解的平衡，抑制ECM 沉积，促进ECM 降解从而减轻肝纤维化。

综上所述，济生肾气汤加三七、鳖甲可改善肝脏纤维化，其具体作用机制可能与改善肝脏炎症坏死，调控ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 信号转导通路后使相关细胞因子水平下降，HSC 活化增殖减少，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β 等基因表达发生下调，减少ECM 在肝组织中的过度生成与堆积等方面有关。

作者贡献度说明：

钟镇康：设计及完成实验、指标检测、论文撰写、数据统计分析；王月明、吴腾、沈新辉：协助完成实验；周晓玲、陆世银：实验指导及论文修改。

本文作者均声明不涉及相关利益冲突。