针刺结合蹊径通脉汤对心肌梗死大鼠ATP 敏感性钾离子通道相关蛋白Kir6.1、Kir6.2 的影响

荐 坤，李兰石，王 颖

（辽宁中医药大学针灸推拿学院，辽宁 沈阳 110847）

急性心肌梗死（AMI）是基于冠脉粥样硬化，由冠状动脉急性缺血、缺氧导致的心肌坏死性疾病［1］。心肌细胞的急性缺血缺氧是AMI 发生发展的机制，因此，能有效遏制心肌细胞发生急性缺血缺氧是治疗的中心。ATP 敏感性钾离子通道（ATP sensitive potassium channel ，KATP通道）是被ATP 浓度影响的内向整流钾通道［2］，被称作是心肌缺血、缺氧缺血再灌注损伤及缺血预适应的终末段效应通道，现已经成为保护心肌细胞相关研究的新方向［3］。KATP通道是由内向整流钾通道亚基（Kir6.1/Kir6.2）和磺酰脲类受体亚基（SUR1/SUR2）两个部分构成的，Kir6.1/Kir6.2 在 通 道 上 形 成 小 孔，SUR1/SUR2 从旁起调节作用。KATP通道在生理情况下处于关闭状态，而当发生缺血或坏死时，会经刺激活化开放，表达量大大增加，加强了IKATP电流的密度，介导了对心肌的保护［4］。

在前期的相关领域，针刺内关穴对瞬时外向钾离子通道和内向整流钾离子通道相关蛋白的调节作用已经被证实［5，6］，本实验将进一步探讨针药结合对AMI 大鼠KATP通道相关蛋白（Kir6.1、Kir6.2）表达的影响，为临床治疗心肌梗死提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SD 大鼠65 只，购自辽宁长生生物科技有限公司［许可证号：SYXK（辽）2013-0009］，体质量（200±20）g，实验操作中遵守实验动物伦理规范，伦理批号：21000092018010，所有大鼠在室温23～25℃、相对湿度45%～55%的同等条件动物饲养房下适应性喂养1 周后，随机取10 只SD 大鼠作空白对照组，其余大鼠经MI 诱导成心肌梗死模型，将造模成功的40 只存活大鼠，随机等分为4 组，包括模型组、针刺组、西药组、针药结合组。

1.2 实验用药与仪器

水合氯醛（索莱公司T8590）；盐酸异丙肾上腺素（美国SIGMA 公司）；生理盐水（辰欣药业股份有限公司）；阿司匹林肠溶片（Bayer，国药准字J20171021）；单硝酸异山梨酯（Lu-nan，国药准字H10940039）。高脂饲料［科澳协力，许可证号：SCXK（京）2019-0001］。自拟蹊径通脉汤由蜈蚣、牛膝、茯苓、水蛭、土鳖虫、降香、白僵蚕、丹参、石菖蒲、麦冬、甘草、川芎、当归组成，来源于辽宁中医药大学附属第一医院并由其制成汤剂。冷藏保存。

生物机能实验系统（泰盟科技，BL-420S）；6805-D 型电针仪（汕头市医用设备有限公司）；华佗牌针灸针（规格0.18 mm×25 mm）（苏州医疗用品厂有限公司）；−80 ℃超低温冰箱（日本SANYO 电器集团）；EPS600 电泳仪（Tanon）；低温离心机（Jouan SA）；多功能酶标仪（TECAN）；超微量核酸蛋白分析仪（Biodrop）等。

1.3 模型制备

对照组大鼠采用普通饲料（15 g/只）喂养3 周，其余大鼠饲以等量高脂肪食物3 周。饮水不限，3 周后描记心电图。对照组的大鼠进行皮下多点位注射生理盐水（85 mg/kg），其他各组大鼠以相同方法进行注射相对等量盐酸异丙肾上腺素（85 mg/kg），间隔24 h 注射1 次，共计2 次，描记心电图。当心电图出现R 波下移、ST 段抬高、病理性Q 波、QRS 波增宽等其他心律失常现象时则可认为造模成功［7］。

1.4 干预方法

针药结合组针刺内关、心俞、足三里穴每日1次，灌服蹊径通脉汤19.35 g·kg-1·d-1，每日1 次；针刺组针刺相同腧穴每日1 次；西药组每日灌服阿司匹林9.00 mg/kg、单硝酸异山梨酯3.6 mg 每日1 次；对照组和模型组均每日灌服等量生理盐水每日1 次。所用腧穴均根据《实验针灸学》［8］中大鼠针灸定位方法进行定位，选取型号为0.18 mm×25.00 mm 的“华佗牌”针灸毫针，顺经斜刺入各组穴位皮下2 mm。接6805-D 型电针仪施以疏密波，频率为2～20 Hz，以大鼠四肢出现轻微震颤为度，留针15 min。依据《实验动物学》确定大鼠每次灌胃剂量，参照公式：成人一日有效量/成人体重（按70 kg 计算）×6.3（折算系数）=X（大鼠一日有效量）×大鼠体重［9］。

1.5 取材

经15 d 干预治疗后，次日将实验大鼠断脊处死，迅速分离心脏组织置于冰袋上，生理盐水清洗后，切取一部分心尖组织，4%的多聚甲醛固定1 d，转至−80℃超低温冰箱冻存备用。

1.6 指标检测

1.6.1 心电图检测 于造模前、后及干预治疗后分别描记心电图。10%水合氯醛麻醉大鼠，随后以腹部向上的姿态固定于操作台，按人体标准导联（Ⅱ）的连接方式，将正极接在左下肢，负极接在右上肢，借助生物机能实验系统描记心电图，观察大鼠T 波电压变化。

1.6.2 各组大鼠心肌组织HE 染色 切取1 cm²的大鼠心尖组织，4%的多聚甲醛进行固定，共1 d，石蜡包埋，二甲苯脱蜡，用于HE 染色。准备70%、80%、90%、95%、100% 各级乙醇，分步进行梯度脱水后甩干，二甲苯透明，镜下观察。

1.6.3 Western Blot 分析 将心肌组织粉碎，装入玻璃匀浆容器内，加入10%裂解液，充分裂解后，置于冷冻离心机（4℃，12 000 r/min）离心，共10 min，取上清液，严格遵循BCA 蛋白试剂盒测定浓度，配置凝胶进行电泳。湿法转入膜上，封闭1 h。配置一抗，将目标蛋白一起放入杂交袋中，37℃的水浴进行震荡1 h 之后，4℃孵育过夜，用TBST 洗膜3 次（5 min/次），同样方法配置二抗，用TBST 洗膜4 次（5 min/次）。使用Tanon5200 化学发光成像仪观察结果。

1.7 统计学处理

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析，计量资料数据用（±s）表示，当P＜0.05 时表示差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心电图T 波电压变化分析

组内比较：与造模前比较，对照组造模后心电图T 波电压无明显改变（P＞0.05），其余4 组造模后心电图T 波电压均显著降低（P＜0.05）；与造模后比较，对照组、模型组、针刺组治疗后T 波电压无明显改变（P＞0.05），西药组、针药结合组T 波电压均显著升高（P＜0.05）。

组间比较：造模前，各组大鼠心电图T 波电压无明显改变（P＞0.05）；造模后，与对照组比较，模型组、西药组、针刺组、针药结合组T 波电压均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、针刺组、针药结合组均无明显改变（P＞0.05）。治疗后，与对照组比较，模型组、西药组、针刺组差异均有统计学意义（P＜0.05），针药结合组T 波电压无明显改变（P＞0.05）；与模型组比较，西药组、针刺组、针药结合组T 波电压均显著升高（P＜0.05）；与西药组比较，针刺组、针药结合组组T 波电压无明显改变（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠T 波电压变化（mV，n=8，±s）Tab 1 T wave voltage changes of rats in each group（mV，n=8，±s）

表1 各组大鼠T 波电压变化（mV，n=8，±s）Tab 1 T wave voltage changes of rats in each group（mV，n=8，±s）

注：与造模前比较，△P＜0.05；与造模后比较，□P＜0.05。与对照组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，■P＜0.05；与西药组比较，●P＜0.05。

组别对照组模型组西药组针刺组针药结合组F P造模前0.157±0.018 0.140±0.042 0.146±0.034 0.138±0.039 0.148±0.032 0.367 0.830造模后0.153±0.015 0.056±0.029△▲0.075±0.032△▲0.079±0.029△▲0.062±0.021△▲19.891 0.000治疗后0.147±0.011 0.060±0.020△▲0.110±0.029△□▲■0.114±0.034▲■0.124±0.022△□■12.071 0.000 0.738 19.671 9.683 5.771 20.706 0.490 0.000 0.001 0.010 0.000 FP

2.2 各组大鼠心肌组织形态学变化

如图1 所示，通过显微镜观察HE 染色的心肌细胞。通过将针刺组、西药组、针药结合组的细胞与空白对照组、模型组的细胞进行比较，发现空白组心肌组织结构正常，排列整齐紧密有序，组织内无明显变性和炎症细胞浸润。但模型组大鼠心肌组织结构异常，大量心肌细胞排列不整齐、不有序，部分心肌细胞较空白组明显萎缩，少量炎症细胞浸润于心肌间隙，部分心肌细胞肥大。针刺组心肌组织结构轻度异常，心肌细胞排列方式较为整齐，心肌间隙可见少量炎症反应细胞浸润。西药组轻度异常，视野上心肌细胞为横切，部分区域间隙较大，可能为制样所致，可见少量结缔组织。心肌组织中含有平行的胶原纤维束及炎性因子。而针药结合组大鼠与其他组大鼠相比，大鼠的心肌组织结构基本正常，排列层次较分明，无明显的炎性细胞浸润组织。

图1 各组大鼠心肌组织HE 染色后的形态学变化（×200）Fig 1 Morphological changes of myocardial tissue of rats in each group after HE staining（× 200）

2.3 各组大鼠KATP 通道相关蛋白Kir6.1、Kir6.2 表达的比较

经Western blot 检测结果表明，与对照组比较，模型组、西药组、针刺组、针药结合组大鼠KATP通道相关蛋白Kir6.1、Kir6.2 的表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组、西药组、针药结合组的Kir6.1、Kir6.2 表达量显著降低（P＜0.05）；与西药组比较，针刺组蛋白表达量变化不显著（P＞0.05），针药结合组显著下降（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 各组大鼠心肌组织中Kir6.1 和Kir6.2 蛋白表达条带Fig 2 Kir6.1 and Kir6.2 protein expression bands in myocardial tissue of rats in each group

表2 各组大鼠心肌组织中Kir6.1 、Kir6.2 蛋白表达的变化（n=8，±s）Tab 2 Changes of Kir6.1 and Kir6.2 protein expression in myocardial tissue of rats in each group（n=8，±s）

表2 各组大鼠心肌组织中Kir6.1 、Kir6.2 蛋白表达的变化（n=8，±s）Tab 2 Changes of Kir6.1 and Kir6.2 protein expression in myocardial tissue of rats in each group（n=8，±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，∧∧P＜0.01；与西药组比较，##P＜0.01；与针刺组比较，＆＆P＜0.01。

Kir6.2 1.104±0.018 2.068±0.078**1.641±0.041**∧∧1.711±0.069**∧∧0.958±0.055**∧∧##＆＆198.789 0.000组别对照组模型组西药组针刺组针药结合组FP Kir6.1 1.453±0.026 2.843±0.040**1.589±0.074**∧∧1.604±0.029**∧∧1.263±0.026**∧∧##＆＆636.099 0.000

3 讨论

随着人们物质生活水平的不断提高，人们对高脂肪食物摄入量的增加，导致心血管疾病发病率极高，已成为世界三大致死疾病之一，因此寻找有效改善AMI 的治疗方法具有重要的临床意义［10］。ATP 作为KATP通道最有效的一种内源性阻滞剂［11］，在大多数情况下，细胞内有足够的ATP 含量，可以与KATP通道上相应的位点结合，达到饱和，从而关闭KATP通道［12］。在心肌缺血状态下，ATP 含量较生理状态有所下降，ATP/ADP 比率下降，KATP通道上的ATP 结合不足，KATP通道活化开放，K+外流增多，心肌细胞复极化或超极化，动作电位时间减少。同时Na+-Ca2+通道受到抑制，细胞Ca2+浓度下降，导致收缩力下降，耗氧量减少，对心肌产生保护［13］。本实验结果表明，AMI 模型中，Kir6.1、Kir6.2 的蛋白表达量均有明显变化，其机制可能与ATP 敏感性钾离子通道的开放有关。

AMI 的 中 医 病 名 为“真 心 痛”［14］，证 属 痰 瘀 互结，因脾失健运，胃失和降而痰浊内生，从而导致经络淤滞，出现心胸憋闷疼痛等症状，其治疗原则为祛瘀化痰，疏通胸中闭塞之气。本实验选取双侧内关穴、足三里穴、心俞穴作为三个刺激点，与王颖教授自拟的蹊径通脉汤结合，针药并用。蹊径通脉汤以丹参为君，活血化瘀止痛，可急救于危难发生之时。王颖教授以水蛭、蜈蚣等“血肉有情之物”为臣，可搜剔疏拔，通达全身。方中配伍麦冬养阴生津润燥，用以制约虫类药物的峻猛及燥烈之性。以川芎、降香为佐，一升一降宣畅气机，理气活血止痛。石菖蒲与茯苓可健脾化痰开窍。报道称，丹参有血管扩张的有效药理学功效，从而增强血运［15］，四种虫类药能使血黏下降，总胆固醇和三酰甘油降至标准范围［16］，麦冬可增强心肌纤维的收缩度，提高心排血量，减少患者心肌耗氧量［17］，牛膝是公认的神经系统保护药物，有效控制梗死面积，减少细胞凋零，遏抑炎症反应，改善心肌功能损伤［18］。

《针灸甲乙经》有：“心澹澹而善惊恐，心悲，内关主之。”之载。内关作为手厥阴心包经的络穴及八脉交会穴，是治疗心脏病的首选［19］，与蹊径通脉汤中的丹参、当归、降香、川芎功效类似，具有宁心安神，理气活血止痛之功。心俞穴乃心之背俞穴，是心气汇聚的地方，可直接通过调节患者心功能，养血宁心，配合虫类药的使用，既活血补血，又通经活络，通补兼施。《玉龙赋》中记载：“心悸虚烦，刺三里。”，足三里作为胃之下合穴，有扶正黜邪之效，可调节脾胃、活化经络、化痰除痹止痛［20］，有助于全身气机升降得宜，协同增强内关、心俞穴与汤药的作用。现代社会医学研究证明，针刺足三里可提高多种胃消化酶的活性，也能增加血量促进血液循环［21］。杜慧静等［22］研究发现，电针内关、心俞穴可以调控心肌组织中细胞因子、生长因子以及炎症因子的释放，调节组织周围的微环境，从而保护缺血梗死区的心肌组织，改善心功能。三穴共用，活血化瘀，和胃化痰，通络止痛。

针药相须，杂合以治，共奏“活血化瘀，化痰通络”之功。针药的协同作用使功能增强，让心肌梗死的胸闷疼痛症状得以缓解。因此，本实验研究表明，针药结合、单纯针刺及临床常规西药均可有效改善MI 大鼠状态，但以针药结合治疗的疗效最佳，其机制可能是通过降低Kir6.1、Kir6.2 的蛋白表达量，影响ATP 敏感性钾离子通道的功能来实现的，Kir6.1、Kir6.2 在心脏中有表达，说明对心脏功能可能有着某些影响，但目前对其研究仍较少，其具体机制还有待进一步研究。

作者贡献度说明：

荐坤：论文主要攥写人；李兰石：论文主要修改者；王颖：论文审稿人及课题项目主要负责人，蹊径通脉汤创作者。