细胞源禽流感病毒三价灭活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株、H7N9 H7-Re3 株）免疫效力研究

刘艳晶，潘舒心，麻 琦，陈晓涵，邓国华，施建忠，包红梅，田国彬，曾显营，陈化兰

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨150069）

禽流感（Avian influenza，AI）是由AI 病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病。到目前为止，高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）已在全球超过60 个国家引发高致病性禽流感（HPAI）疫情，给世界养禽业造成巨大经济损失。2004 年以来，为有效防控HPAI，我国主要采取疫苗免疫联合扑杀感染家禽的综合防控措施。AIV 在自然界中不断进化，抗原性逐渐发生变异，导致疫苗保护效果下降，需要不断更新疫苗株，才能保障疫苗的免疫保护效果。2004 年以来，我国研制的一系列疫苗在家禽中大规模应用，已取得理想防控效果[1]。

2013 年，我国出现H7N9 流感病毒感染并致人死亡的病例，随后连续引起5 波次共1 564 人感染病例，其中第5 波次共有766 人感染，引起人们对下一波疫情会有更多人感染的担忧。在人H7N9 流感疫情期间，人们由于恐惧而不敢食用家禽产品，造成禽蛋产品滞销，给养禽业造成巨大经济损失。2017 年初，H7N9亚型AIV 由低致病性突变为高致病性，并在多个省份的家禽中引起疫情[2-4]，导致严重经济损失；研究还发现H7N9 亚型HPAIV 对人的危害更大[2]。国家禽流感参考实验室研制出重组AIV（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株），自2017年9 月在我国家禽中使用后有效抑制了H5 和H7 亚型AIV 在家禽中的流行，阻断了人H7N9 流感疫情[5]。持续监测数据表明：H5 和H7 亚型AIV 抗原性发生变异，为了达到良好免疫效果，将疫苗更新为重组AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株），并于2018 年底在家禽中应用。

为升级疫苗生产工艺，提高疫苗生产过程中的生物安全防护和减少废弃物处理，国家禽流感参考实验室联合相关生物制品企业研制出细胞源AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）。本研究对3 批细胞源重组AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）进行免疫效力检测，同时评估了其对2019 年监测到的H7N9 亚型AIV 变异株及H5 亚型2.3.4.4h 分支、2.3.2.1d 分支的流行代表株的免疫保护性，为该疫苗进一步推广应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 3 批细胞源AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）（简称为细胞源三价疫苗）（2020001-s 批、2020002-s 批、2020003-s 批），由吉林冠界生物技术有限公司制备。SPF 鸡胚、SPF 鸡3 周龄、6 周龄SPF 鸡均由依托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的国家禽类实验动物资源库提供。H5 亚型Re-11 株、Re-12 株HI 试验抗原和H7 亚型H7-Re3 株HI 试验抗原由国家禽流感参考实验室制备。本研究攻毒用病毒株信息见表1，各病毒株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存。

表1 H5和H7亚型AIV病毒株Table 1 The information of H5 and H7 subtype AIV strains

1.2 3 批细胞源三价疫苗效力试验 将90 只3 周龄SPF 鸡随机分成3 组，每组30 只，以颈部皮下注射途径各接种1 批细胞源三价疫苗（0.3 mL/只）；另取相同日龄SFP鸡30只，不接种疫苗，作为对照组。疫苗接种后21 d，采集所有试验鸡血清，参照国家标准（GB/T-18936-2003），分别利用H5亚型AIV Re-11株、Re-12 株和H7 亚型血凝抑制抗原测定每组鸡的HI 抗体效价：免疫后21 d，各疫苗组和对照组随机各选取10只鸡，鼻腔感染H5亚型AIV DK/GZ/S4184/2017株（H5N6）含[100 半数鸡致死量（CLD50）]，进行疫苗对H5 亚型2.3.4.4h分支病毒的免疫效力检验。同样方式分别感染H5 亚型AIV 病毒CK/LN/SD007/2017 株（H5N1）（含100 CLD50）和CK/IM/SD010/2019（H7N9）（含100 CLD50），进行疫苗对H5 亚型AIV 2.3.2.1d 分支病毒和H7N9 病毒的免疫效力检验。攻毒后观察14 d，攻毒后第3 d 和第5 d 采集每只鸡喉头和泄殖腔拭子，经尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚进行病毒滴定。

1.3 疫 苗 对H5 亚 型2.3.4.4h 和2.3.2.1d 分 支AIV 分离株的效力评估 选择2020001-s 批三价疫苗以颈部皮下注射方式接种20 只3 周龄SPF 鸡，接种剂量为0.3 mL/只， 20 只同日龄SPF 鸡，不接种疫苗，作为对照组。各组接种后21 d，所有鸡各采血分离血清，采用H5 亚型AIV（Re-11 株、Re-12 株）血凝抑制抗原测定该组鸡的HI 抗体效价。具体试验方法根据国家标准（GB/T-18936-2003）进行。同时，免疫后21 d，各疫苗组和对照组随机各选取10 只鸡，以鼻腔感染途径分别感染H5亚型AIV 2.3.4.4h分支H5N6亚型AIV（DK/JX/S40947/2019 株，含105EID50）；另取10 只免疫鸡和10 只对照鸡，感染H5N1 亚型AIV 2.3.2.1d 分支（CK/LN/2/2019 株，含105EID50）。攻毒后第3 d 和第5 d 采集每只鸡喉头和泄殖腔拭子，经尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚进行排毒检测，评估疫苗对H5 分离株的效力。

1.4 疫苗对H7 亚型AIV 分离株的免疫保护效力评估 将2020001-s 批三价疫苗以0.3 mL/只、肌肉注射途径接种30只3周龄SPF 鸡，并设30只同周龄SPF 鸡不免疫作为对照组。免疫后3 周，采血并分离血清，用H7 亚型H7-Re3 株抗原检测HI 抗体。采血后各疫苗组和对照组随机各选取10 只鸡，使用H7 亚型AIV PCK/LN/SD004/2019（H7N9）（105EID50）进 行 攻 毒 试验；相同方法进行疫苗对CK/LN/SD25/2019（H7N9）和DK/FJ/SE0195/2018（H7N2）分离株的攻毒试验。攻毒后观察临床症状和排毒检测，方法同1.3。

2 结 果

2.1 3 批次疫苗接种SPF 鸡后的HI 抗体检测及效力试验结果 将3 批细胞源三价疫苗接种3 周龄SPF鸡，免疫后3 周，采血分离血清，HI 抗体效价检测结果显示， 针对H5 亚型Re-11 株平均HI 抗体效价分别为8.1log2、7.9log2 和7.9log2，针对H5 亚型Re-12 株 平 均HI 抗 体 效 价 分 别 为8.3log2、7.9log2 和8.2log2，针对H7 亚型H7-Re3 株平均HI 抗体效价分别为7.7log2、7.7log2 和8.0log2，对照组HI 抗体效价均为阴性（图1）。结果表明，3 批细胞源三价疫苗均具有良好的免疫原性。

图1 三价疫苗免疫SPF鸡后3周的HI抗体效价测定结果Fig.1 HI antibody detection of SPF chickens immunized with the trivalent vaccine at 3 weeks post vaccination

用DK/GZ/S4184/2017 株（H5N6，2.3.4.4h 分支）、CK/LN/SD007/2017（H5N1，2.3.2.1d 分 支）、CK/IM/SD010/2019（H7N9）效力检验用病毒攻毒后14 d 观察期内，所有免疫组鸡均全部健活，且未从免疫组鸡喉头和泄殖肛拭子分离到病毒；对照组鸡在攻毒后2 d 开始发病，3 d 后开始出现死亡，并在攻毒后6 d全部发病死亡，而且病毒分离率为10/10（表2）。结果表明，3 批细胞源三价疫苗具有良好的免疫效力。

表2 3批细胞源三价疫苗的效检检测结果Table 2 The protection efficacy of the chickens immunized with cell-cultured trivalent vaccine

2.2 三价细胞源疫苗对H5 亚型2.3.4.4h 和2.3.2.1d分支AIV 流行株的免疫效力结果 将细胞源三价疫苗免疫3 周龄SPF 鸡3 周后，采血分离血清测定HI抗体，结果显示， 针对H5 亚型Re-11 株平均HI 抗体效价为7.8log2，针对Re-12 株平均HI 抗体效价为为8.1log2，对照组鸡抗体均为阴性。结果表明细胞源三价疫苗对H5 亚型2.3.4.4h 和2.3.2.1d 分支AIV 流行株有良好的免疫原性。

免 疫21 d 时 感 染H5N6 亚 型2.3.4.4h 分 支AIV（DK/JX/S40947/2019 株）和H5N1 亚 型2.3.2.1d 分 支AIV（CK/LN/2/2019 株）后结果显示，免疫组鸡均全部健活，且均未分离到病毒；2 组对照组鸡攻毒2 d 后开始发病，3 d 后开始出现死亡，4 d 全部发病、死亡，而且10/10 病毒分离阳性（表3）。上述结果表明细胞源三价疫苗针对H5 亚型2.3.4.4h 和2.3.2.1d 分支AIV 流行株具有良好免疫效力。

表3 三价疫苗免疫鸡对H5亚型2.3.4.4h和2.3.2.1d分支AIV攻毒试验结果Table 3 The protection efficacy of immunized chickens against the challenge of H5N6 subtype clade 2.3.4.4h andH5N1 clade 2.3.2.1d viruses isolated in poultry

2.3 三价细胞源疫苗对H7 亚型AIV 流行株的免疫效力结果 用3 批细胞源三价疫苗免疫3 周龄SPF 鸡3 周后，采血分离血清，检测针对H7 亚型AIV 的HI 抗体。结果显示，细胞源三价疫苗免疫后3 周H7 亚型H7-Re3 株平均HI 抗体效价分别为7.7log2、7.9log2 和7.7log2，对 照 组 抗 体 均 为 阴 性，结果表明细胞源三价疫苗可诱导SPF 鸡产生针对H7亚型AIV 的HI 抗体。

细胞源三价疫苗免疫21d 时分别攻击2 株H7N9亚型AIV 抗原变异株（PCK/LN/SD004/2019 和CK/LN/SD25/2019）和1 株H7N2 亚型AIV（DK/FJ/SE0195/18）后结果显示，免疫组鸡均全部健活，且均未分离到病毒；3 组对照组鸡攻毒2 d 后开始发病，3 d 后开始出现死亡，6 d 后鸡全部发病、死亡，而且10/10 病毒分离阳性（表4）。上述结果表明，3批细胞源三价疫苗对H7亚型AIV抗原变异株具有良好免疫效果。

表4 三价疫苗免疫鸡对H7N9分离株攻毒试验结果Table 4 The results of protection efficacy of the trivalent vaccine-immunized chickens against the challenge of H7 subtype viruses

3 讨 论

HPAIV 因其在禽类中传播快、危害大、死亡率高，对人类和动物的健康构成严重威胁，成为优先防控的家禽传染病。疫苗接种是一种重要的防控策略，可有效控制HPAI 疫情的暴发[6]。H5N1 亚型AIV引起的AI 疫情于2004 年出现，造成严重的经济损失，2005 年针对该亚型AI 防控疫苗开始使用，并取得良好的效果[7-8]。但由于AIV 高度变异的特性，致其抗原性不断发生变异，这就使得防控疫苗需要不断更新，目前Re-11、Re-12 株疫苗被用于防控H5亚型HPAI[9]。2017 年初低致病性H7N9 亚型AIV 突变为HPAIV，并导致我国多个省出现HPAI疫情[10]。针对H7 亚型AIV 的H5+H7 二价疫苗使用后，有效控制了我国家禽和人H7N9流感，但H7亚型疫苗株也在及时更新，H7-Re1 疫苗株于2018 年12 月更新为H7-Re2疫苗株，2020 年7 月又被更新为H7-Re3 疫苗株。因此，AI防控疫苗毒种的及时更新是保障疫苗免疫效果的关键环节。本研究中的细胞源三价灭活疫苗就是针对更新后的H7-Re3 疫苗株所作的免疫效力评估。

当前用于防控禽流感的疫苗大多为鸡胚生产，但鸡胚生产工艺受到许多限制，比如：鸡胚来源、大量鸡胚残体处理、难以进行产量快速放大和智能化生产。而细胞悬浮培养作为一种新的疫苗生产工艺，生产的禽流感疫苗与传统方法相比具有生产周期短、疫苗质量更容易控制、产量快速放大、无鸡胚残体处理、人力成本低等优点。一种悬浮细胞生产重组AIV 灭活疫苗的方法已申请专利，表明无血清全悬浮细胞培养方法是切实可行的，该技术解决了传统工艺的弊端，将有效推动动物疫苗生产工艺的升级。研究表明，从相应的细胞培养生产的疫苗免疫应答效果和用鸡胚生产的疫苗在安全性和免疫原性及免疫效果方面无显著差异[11]。本研究中的细胞源三价灭活疫苗以0.3 mL 的剂量免疫SPF 鸡21d后，测定的H5 亚型Re-11 株、Re-12 株和H7 亚型H7-Re3 株HI 抗体效价均在7.7log2 以上，产生的抗体比较均衡。将效力检验用病毒株以100 CLD50采用鼻腔感染的方式攻击免疫鸡后，结果显示免疫鸡均获得完全保护；在对近期流行株的保护效果试验中，免疫后的SPF 鸡针对3 种抗原的HI 抗体效价均在8log2 以上，以105EID50攻击AIV 后所有免疫组鸡均获得完全免疫保护。以上试验结果表明，正如鸡胚源疫苗一样，细胞源疫苗也具有良好的安全性和免疫效果。

本研究评估了3 批细胞源AIV（H5+H7）三价灭活细胞疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）的免疫效力及疫苗对流行株的免疫保护性，结果表明该细胞源疫苗可以作为当前防控我国H5亚型和H7 亚型AI 的疫苗，本研究数据为细胞疫苗生产工艺的大规模应用提供了基础。