非洲猪瘟病毒DP148R 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

王永琦，郑 君，翁长江

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，临床上以高热、食欲废绝、皮肤发绀、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统紊乱为主要特征[1-3]，急性感染可导致家猪死亡率接近100%[4]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病[5]，我国在《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》中，将ASF 列为优先防范的13 种重大动物疫病之一。

2000 年病毒分类委员会第7 次报告中将ASFV 归属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属[6]。ASFV 是目前发现唯一的虫媒DNA 病毒，呈二十面体结构，外有囊膜包被[7]。病毒基因组末端以共价键闭合，长度170 kb～190 kb，含有151个开放阅读框（ORFs），编码150～200 种蛋白质[8]，其中50 多种为病毒的结构蛋白。ASFV 基因组大致由3 部分组成：中部为长度约125 kb 的保守区、两端分别为38 kb～48 kb 和13 kb～22 kb 的可变区及基因组末端约2.1 kb～2.5 kb 的反向重复序列[9]，两端可变区的差异是不同病毒株的主要区别，该区包含5 个多基因家族（MGF）：MGF-360、MGF-300、MGF-110、MGF-100、MGF-505/530，pDP148R 蛋白属于MGF-360 家族，这些基因家族均有发生变异的可能性，包括基因重组、缺失和突变等。

DP148R 是ASFV 复制过程中的早期表达蛋白，在病毒Benin 97/1 株中该蛋白由254 个氨基酸组成，而在病毒BA71V 株中其是由148 个氨基酸组成，在病毒HLJ/18 株中其是由237 个氨基酸组成，可见在不同的ASFV 株中表达的DP148R 蛋白大小有所区别。另外有报道表明，在病毒Benin 97/1 株中敲除该基因不会影响ASFV 在巨噬细胞中的复制，但可以大大降低病毒的毒力[10]；利用基因缺失的Benin-ΔDP148R 株免疫猪，能够诱导其高水平的免疫保护，仅引发猪轻度的临床症状，并可以抵抗亲本病毒的攻击，表明该蛋白在ASFV 感染宿主细胞的过程中发挥重要功能，但具体的作用机制尚不清楚。为了进一步研究DP148R 蛋白的生物学功能，本研究表达并纯化了重组DP148R 蛋白，经免疫小鼠、融合筛选，最终获得了1株具有良好反应性的DP148R蛋白单克隆抗 体（MAb），为鉴定DP148R 在ASFV 致病性中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 ASFV HLJ/18 株由本研究所分离并保存；HEK293T、骨髓瘤（SP2/0）细胞由本实验室保存；猪肺泡巨噬细胞（PAMs）分离自30 日龄SPF猪；E. coliDH5a、E. coliBL21（DE3）感受态细胞购自TaKaRa 公司；原核表达载体pET-28a、pGEX-6P-1 由本实验室保存；pCAGGS-Flag-DP148R 真核表达质粒由本实验室合成并保存；ASFV p72 蛋白多克隆抗体由本实验室制备并保存；SPF 级6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、DNA 分子质量标准物均购自TaKaRa 公司；限制性内切酶EcoR I、BamH I、XhoI 购自NEB 公司；同源重组试剂盒购自Vazyme 公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自QIAGEN 公司；DMEM 培养基、胎牛血清购自Gibco 公司；Ni2+亲和层析介质购自通用电气医疗集团生命科学部；PEG 融合剂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT 培养基添加剂、多聚甲醛、多聚赖氨酸、Triton X-100 和FLAGAgarose beads 购自Sigma 公司；TMB 显色液购自天根生化科技（北京）有限公司；AlexaFlour®594 标记的山羊抗鼠IgG 购自Invitrogen 公司；His 和FLAG 标签蛋白的MAb 购自Abmart 公司； DyLight®800 标记的山羊抗鼠和抗兔IgG 购自LICOR 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、小鼠MAb Ig 亚类鉴定试剂盒购自北京博奥龙免疫技术有限公司；胰蛋白酶和PBS 由哈尔滨兽医研究所诊断中心提供。

1.3DP148R基因的克隆及重组质粒的构建 根据GenBank 中 登 录 的ASFV HLJ/18 株DP148R基 因 序列，设计引物DP148R-F: 5'-CAGCAAATGGGTCGC GGATCCATGTTAGAAATAGTATTG-3'（下 划 线 处 为BamH I 酶切位点）；DP148R-R: 5'-GTGGTGGTGGT GGTGGTGCTCGAGCTGGAGCAGCAGTAAGAAG-3'（下划线处为XhoI 酶切位点）。以ASFV 基因组DNA 为模板，DP148R-F/DP148R-R 为引物，通过PCR 方法扩增DP148R 基因。将PCR 产物克隆于经EcoR I 和BamH I 双酶切的pET-28a（+）载体中，构建重组质粒pET-28a-DP148R，并经PCR 和测序鉴定后于-20 ℃保存备用。

1.4 重组DP148R 蛋白的原核表达与纯化 将鉴定正确的重组质粒pET-28a-DP148R 转化到E. coliBL21（DE3）感受态细胞中，37 ℃220 r/min 培养至OD600nm值为0.6～0.8，加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，37 ℃220 r/min 诱导4 h。收集细菌并超声破碎，离心后收集上清和沉淀，分别经SDS-PAGE 鉴定重组蛋白的表达。利用Ni2+柱亲和层析纯化His-DP148R重组蛋白，测定蛋白浓度，以制备的鼠抗His 标签MAb 为一抗（1∶3 000），以DyLight®800 标记的山羊抗鼠IgG 为二抗（1∶10 000），通过western blot 鉴定纯化的重组蛋白并置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 重组DP148R 蛋白MAb 的制备 以纯化的重组DP148R 蛋白为免疫原，按常规方法免疫6 周龄雌性BALB/c 小鼠[11]，经4 次免疫后无菌取出脾脏，分离脾细胞并制备悬液，将处于对数生长期的SP2/0 骨髓瘤细胞与脾细胞以1∶1～1∶10 的比例置于50 mL 离心管中进行细胞融合。经间接ELISA 方法筛选稳定分泌抗DP148R 蛋白MAb 的杂交瘤细胞株，并及时扩大培养及冻存。将300 μL 弗氏不完全佐剂经腹腔注射8 周龄BALB/c 小鼠，使其致敏，同时用筛选到的阳性杂交瘤细胞制备悬液，并按1×105个细胞/只注射于致敏的BALB/c 小鼠腹腔内，5 d～7 d 后收集腹水，置于-20 ℃保存备用。

1.6 MAb 效价的测定 利用小鼠MAb Ig 亚类鉴定试剂盒对已制备的MAb 进行鉴定。将纯化的重组DP148R 蛋白包被ELISA 板，含5%脱脂乳的PBST 于37 ℃封闭2 h。以制备的不同稀释度的DP148R 蛋白MAb作为一抗（从1∶102～1∶106），以阴性小鼠血清作为对照，以羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）作为二抗，经间接ELISA 方法检测MAb 的效价。

1.7 MAb 识别的抗原表位的鉴定 将全长DP148R基因进行部分重叠截短，截短的各个片段分别克隆至BamH I 和EcoR I 酶切的pGEX-6P-1 载体中，通过E. coliBL21(DE3)表达截短的重组蛋白。以截短的重组蛋白为抗原，以DP148R 蛋白MAb（1∶1 000）为一抗，DyLight®800 标记的山羊抗鼠IgG（1∶10 000）为二抗，经western blot 检测。将MAb 识别的片段再逐步截短表达，直到筛选到最小的抗原表位。

1.8 MAb 反应原性的western blot 鉴定 分别将0.5 μg、1 μg、2 μg 真 核 表 达 质 粒pCAGGS-Flag-DP148R 转染到HEK293T 细胞中，24 h 后收集细胞；同时利用ASFV HLJ/18 株感染PAMs 细胞，分别在12 h、24 h、36 h 和48 h 收 集 细 胞。用 含1% NP40 Lysis buffer 裂解细胞并收集上清，以鼠DP148R 蛋白MAb（1∶500）作为一抗，DyLight®800 标记的山羊抗鼠IgG（1∶10 000）作 为 二 抗，经western blot 检 测HEK293T 细胞中表达的Flag-DP148R 蛋白及ASFV 感染的PAMs 细胞中表达的DP148R 蛋白，分析MAb 的反应原性。

1.9 MAb 反应原性的间接免疫荧光试验（IFA）鉴定 将pCAGGS-Flag-DP148R 质粒转染至HEK293T细胞中，24 h 后固定细胞，0.3% Triton X-100 室温透膜15 min，10% FBS 室温封闭2 h，以鼠DP148R蛋白MAb（1∶50）作为一抗，Alexa Flour®594 标记的羊 抗 鼠IgG（1∶2 000）作 为 二 抗， 经IFA 检 测HEK293T 细胞中表达的Flag-DP148R 蛋白与ASFV 感染的PAMs 细胞中表达的DP148R 蛋白，进一步分析MAb 的反应原性。

2 结 果

2.1 ASFV 重组DP148R 蛋白的表达与纯化 将经PCR 及测序鉴定正确的重组质粒pET-28a-DP148R转化E. coliBL21（DE3）并诱导表达，SDS-PAGE 结果显示，在27 ku 处有一条目的条带，且蛋白主要在重组菌裂解液的沉淀中，与预期一致（图1A）。通过亲和层析纯化目的蛋白并利用His 抗体经western blot鉴定，结果显示在27 ku 处有一条特异性条带，且无杂带（图1B）。表明重组DP148R 蛋白获得了表达，且对该蛋白的纯化效果较好。

图1 ASFV重组DP148R蛋白表达的SDS-PAGE（A）及其纯化的western blot（B）鉴定结果Fig.1 The SDS-PAGE(A)of the ASFV recombinant DP148R protein expressed in E.coli and the western blot(B)of the purified protein

2.2 MAb 效价的测定 将ASFV 重组DP148R 蛋白免疫小鼠后的脾细胞与SP2/0 细胞融合，经3 次克隆纯化，最终获得1 株稳定分泌DP148R 蛋白MAb 的杂交瘤细胞株。利用这株细胞注射BALB/c 小鼠腹腔，将获得的MAb 命名为7D6。利用抗体亚类鉴定试剂盒鉴定该MAb 为IgG2b 亚型。利用间接ELISA 方法测定7D6的效价，当7D6以1∶105稀释时，其与阴性血清OD450nm值之比（P/N）≥2.1，因此7D6的效价为1∶105。

2.3 7D6 识别的抗原表位鉴定 将全长DP148R 重组蛋白第一次截为8 段，并分别作为抗原进行west⁃ern blot鉴定，结果显示aa1～aa50肽段能够被7D6识别（图2A）；将重叠部分第二次截为8 段，结果显示aa21～aa40 肽段能够被7D6 识别（图2B）；将重叠部分第三次截为11 段，结果显示aa29～aa38 能够被7D6识别，且MAb 7D6 与其余片段均不反应（图2C），表明DP148R MAb 识别的抗原表位位于DP148R 蛋白的aa29～aa38，序列为“LYWVFRAIHI”。

图2 Western blot鉴定7D6识别的抗原表位Fig.2 Identification of antigenic epitopes recognized by 7D6 by western blot

2.4 MAb 反应原性的western blot 鉴定结果 将不同浓度的pCAGGS-Flag-DP148R 真核表达质粒分别转染到HEK293T 细胞中，24 h 后收集细胞；同时利用ASFV HLJ/18 株感染PAMs 细胞不同时间，收集细胞沉淀。上述细胞裂解后均经western blot 鉴定。结果显示，7D6 可以识别HEK293T 细胞中表达的Flag-DP148R 蛋白，该蛋白也可以被Flag 标签抗体识别，其大小与预期结果一致，且随着转染质粒浓度的增加，抗体能够识别的蛋白水平也逐渐增加（图3A）；7D6 也可以识别PAMs 细胞中表达的DP148R 蛋白，且随着ASFV HLJ/18 株感染时间的延长，MAb 识别的DP148R 蛋白水平也呈现逐渐增加的趋势。P72 蛋白为ASFV 编码的衣壳蛋白，利用P72 的抗体检测是为了证明病毒在细胞中获得了复制且随着感染时间的增加其复制水平增加（图3B）。结果表明DP148R MAb能够在western blot 检测中特异性识别在HEK293T 细胞中表达的DP148R 蛋白和ASFV 感染的PAMs 细胞中表达的DP148R 蛋白，反应原性较强。

图3 Western blot鉴定MAb的反应原性Fig.3 The reactivity of MAb was identified by western blot

2.5 DP148R 蛋白MAb 反应性的IFA 鉴定结果 将pCAGGS-Flag-DP148R 真核表达质粒转染到HEK293T细胞；同时用ASFV感染PAMs细胞，然后用多聚甲醛固定细胞进行IFA 检测。结果显示，制备的MAb 7D6与Flag 标签抗体均检测到了HEK293T 细胞内表达的Flag-DP148R 蛋白，呈现红色荧光（图4A），同样7D6也能够检测到ASFV 感染PAMs 细胞内表达的DP148R蛋白，呈现红色荧光，P72抗体的作用与2.4中描述的一样（图4B）。表明纯化的DP148R蛋白MAb能够用于IFA 检测HEK293T细胞中表达的DP148R蛋白和ASFV感染的PAMs细胞中表达的DP148R蛋白，进一步表明制备的MAb的反应原性较强。

图4 IFA鉴定MAb 7D6的反应原性Fig.4 The reactivity of MAb 7D6 was identified by IFA

3 讨 论

作为中国一类动物传染病的ASF，自2018 年8月在辽宁省沈阳市首次报道后，疫情迅速蔓延至全国各地[12]，其强毒株感染的发病率和致死率可高达100%，给我国的养猪业带来了沉重的打击。目前疫情的防控手段主要包括流行病学检测、划定疫区、扑杀和净化等[13-14]，依靠生物安全和扑杀措施控制ASF 难度很大，迫切需要研发有效疫苗。基因缺失减毒活疫苗是有潜力和希望的一种ASF 疫苗研发策略，有报道显示，通过基因编辑技术构建的一株7个基因缺失的重组ASFV（HLJ/18-7GD）能对ASF 强毒的致死性攻击提供有效的抵抗能力[15]。DP148R基因是参与ASFV 感染宿主过程的重要毒力相关基因，在病毒感染细胞后的早期表达。在ASFV Benin 97/1 株中敲除DP148R基因不会降低病毒在巨噬细胞中的复制水平，但是可以大大降低病毒的毒力。利用BeninΔDP148R 病毒通过肌肉注射和鼻腔途径免疫猪后，可以抵抗亲代ASFV 强毒的攻击，肌肉途径免疫组的猪全部存活，鼻腔途径免疫组除了一只猪死亡外全部存活[10]，说明DP148R基因也有望成为ASF 疫苗研制中的有效靶点，但目前对于DP148R基因的功能研究尚不完善，DP148R 蛋白具体的生物学功能仍待阐明。

本研究采用原核表达系统表达并纯化了重组DP148R 蛋白。相对于真核细胞表达而言，原核表达能够在较短时间内获得大量基因表达产物，实验效率高，而且所需的成本相对比较低廉。郝丽影等采用大肠杆菌原核表达系统表达ASFV 重组p30 蛋白，制备并鉴定了p30 蛋白的MAb，腹水抗体效价达1∶40 000，且具有良好的特异性和反应性[16]；向志达等利用原核表达载体构建的重组表达质粒pET-21a-A137R，成功表达ASFV pA137R 蛋白，由此制备的兔源多克隆抗体能特异性识别瞬时表达的Flag-A137R 蛋白和ASFV 感染PAM 细胞中表达的ASFV A137R 蛋白，说明采用原核表达系统表达蛋白并制备MAb 是可行且应用广泛的[17]。虽然重组DP148R蛋白主要以包涵体形式表达，但通过western blot 和IFA鉴定，证明该MAb 可以识别并结合HEK293T细胞中表达的Flag-DP148R蛋白和ASFV感染PAMs细胞中的内源性DP148R 蛋白，说明制备的MAb 具有良好的反应原性。由于使用His-DP148R 蛋白作为免疫原，所以在进行间接ELISA 筛选试验时，先采用His-DP148R 蛋白作为包被抗原初步筛选阳性克隆，再用专门的His 标签抗原包被酶标板，细胞上清作为一抗进行间接ELISA 检测，挑选出重组His-DP148R蛋白OD450nm值阳性，且His 标签蛋白OD450nm值为阴性的细胞孔继续试验，排除了针对His 标签的克隆，保证筛选到针对DP148R 蛋白的特异性MAb 细胞株。

本研究制备了特异性识别ASFV DP148R 蛋白的鼠源MAb 7D6，该MAb 的效价较高，反应原性良好，为进一步鉴定DP148R 蛋白的生物学功能及其在ASFV 感染和致病性中的作用提供了良好的材料。