噬菌体防治ETEC 感染小鼠效果的初步研究

胡乐玉，宋 鹏，崔嘉琪，邹 玲，刘文华，张 灿，韩先杰，任慧英

（青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109）

产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起新生仔猪及断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一，其致病作用与其具有的黏附性菌毛密切相关[1-2]。致仔猪腹泻ETEC 的血清型主要有K88、K99 和987p，其中含有K88 菌毛的ETEC 是引起仔猪腹泻最主要的病原菌，该菌感染后治疗不及时会导致仔猪发病死亡[1-4]。

目前，抗生素是治疗仔猪细菌性腹泻最常用的手段，但随着抗生素在临床的大量使用，大肠杆菌的耐药性逐渐增强，抗生素的临床应用效果逐渐变差。预防ETEC 腹泻的首选方法是使用能激发宿主产生针对黏附素免疫力和抗肠毒素免疫力的疫苗，但ETEC 血清型众多，至今尚无一种疫苗能有效防治各个血清型ETEC 的感染[5]。长期以来，我国养猪业一直遭受着ETEC 感染带来的严重经济损失，亟需研发防治仔猪腹泻的理想药物。

噬菌体可以特异性感染宿主菌，在其中增殖并快速杀灭宿主菌，增殖后释放的子代噬菌体还可以继续感染并杀灭细菌，这种作用不受细菌耐药性的限制，而且噬菌体作用的特异性决定了其不会破坏动物体的正常菌群，对人和动物安全，是一种绿色的抗生素替代品，在医学和兽医临床已有过许多成功的应用[6-8]。本研究通过小鼠模型来探究噬菌体对致仔猪腹泻ETEC 感染的防治效果，旨在为噬菌体用于仔猪大肠杆菌病的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 ETEC K88、K99 和987p 菌株由本实验室保存；噬菌体DS2 及其宿主菌S2 均由本实验室从驴的粪便样品中分离并保存；DS2 噬菌体增殖液经离心及0.22 μm 滤膜过滤，无菌检验合格。S2 为经16S rRNA 测序鉴定的沙门氏菌；SPF 级BALB/c 成年小鼠购自青岛大任富城畜牧有限公司。普通营养琼脂、LB 琼脂、SS 琼脂等购自青岛海博生物技术有限公司；内毒素检测鲎试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；小鼠细胞因子IL-1β ELISA 试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2 噬菌体的增殖及效价测定 参照文献[9]中的方法将噬菌体与ETEC 共增殖，即在5 mL LB 肉汤中分别 加 入100 μL 新 鲜S2 菌 液 及10 μL DS2 噬 菌 体（2.5×109pfu/mL），并设立不加噬菌体的对照，37 ℃220 r/min 培养。待对照组液体逐渐浑浊，噬菌体组先浑浊随后逐渐清亮时，采用LB 肉汤将噬菌体增殖液10 倍倍比稀释，取106、107倍稀释液各220 μL，分别与新鲜S2 菌液220 μL 混合加入到无菌EP 管中，37 ℃孵育5 min 后，取200 μL 加入预热融化的上层琼脂（琼脂浓度为0.7%）中，混匀后迅速倒入下层营养琼脂（琼脂浓度为1.5%）板上，倾斜旋转使分布均匀，每个稀释度做两个平行。待琼脂凝固后37 ℃倒置培养6 h～8 h，参照文献[10]中的双层平板法观察结果并计算噬菌体效价。

1.3 DS2 噬菌体对ETEC 体外裂解作用的测定 参照文献[11]中双层琼脂空斑试验，将200 μL 新鲜K88、K99 和987p 菌液分别加至溶解好的上层琼脂中，混匀后迅速倾倒在下层营养琼脂板上，倾斜旋转使分布均匀，待琼脂凝固后，将10 μL DS2 噬菌体点于其上，正置于37 ℃培养4 h～5 h 后观察结果，若有空斑产生则证明DS2 对该菌具有裂解能力。另外，将100 μL 新鲜K88、K99 和987p 菌液分别采用1.2 所述方法处理，若对照组液体逐渐浑浊，噬菌体组先浑浊随后逐渐清亮，则说明DS2 可有效裂解该菌株。

1.4 小鼠实验设计 将30 只健康小鼠随机分为高剂量噬菌体预防组（简称高剂量组）、低剂量噬菌体预防组（简称低剂量组）及无噬菌体的感染对照组（简称对照组），每组10 只。参照文献[12-13]，将小鼠经腹腔分别注射0.2 mL 高（1×108pfu/只）、低剂量（1×107pfu/只）的DS2 噬菌体，对照组小鼠经腹腔注射0.2 mL 的噬菌体培养液LB 肉汤。1 h 后，对各组 小 鼠 经 腹 腔 注 射0.2 mL 的K88、K99 及987p混合菌液（每种菌终浓度均为3×108cfu/只），并作后续试验。

1.5 各组小鼠肝脏载菌量及噬菌体含量的测定 分别于感染后12 h、24 h、48 h 采用引颈法迫杀各组3只小鼠，无菌采集肝脏，称重后加入1 mL PBS 使用无菌研磨器研磨。将研磨液10 倍倍比稀释至104倍，取各浓度肝脏稀释液50 μL，分别分多次点在SS 琼脂培养基上，每个稀释梯度做两个平行，37 ℃倒置过夜培养，观察结果并采用平板计数法计算小鼠的肝脏载菌量。将各浓度肝脏稀释液与新鲜S2 菌液共孵育，采用1.2 所述双层平板法，测定小鼠肝脏噬菌体的含量。

1.6 小鼠血液IL-1β 及内毒素含量的测定 感染后24 h，各组随机选择3 只小鼠，摘眼球采血，分离血清，利用ELISA 试剂盒检测小鼠细胞因子IL-1β含量。感染后48 h，各组随机选择3 只小鼠采集抗凝血，3 000 r/min 离心30 min，分离血浆，置于不含热原质和内毒素的试管中，使用内毒素检测鲎试剂盒测定各组小鼠血浆内毒素的含量。

1.7 小鼠临床症状评分及存活率的测定 将60 只小鼠分成3 组，每组20 只，参照1.4 的实验设计，对小鼠注射相应培养物后，观察并记录感染后72 h内各组小鼠的发病率和死亡率，并统计感染后12 h、21 h、24 h、36 h、48 h、72 h 每只小鼠的体况得分，判定标准为：死亡0 分，濒临死亡1 分，部分闭眼、眼周有渗出液2 分，嗜睡、弓背3 分，运动减少、被毛粗乱4 分，正常、健康者5 分，根据结果绘制小鼠体况计分图及存活率曲线。

2 结 果

2.1 DS2 噬菌体效价的测定及其对ETEC 的体外裂解结果 采用双层平板法测得DS2 噬菌体的效价为6.9×109pfu/mL，并采用双层琼脂空斑试验及与ETEC共增殖检测噬菌体对ETEC 的体外裂解作用。双层琼脂空斑试验结果显示，DS2 噬菌体均可在K88、K99 及987p 平板上形成透明噬斑（图1A）；与ETEC共增殖结果显示，DS2 噬菌体可在共增殖6 h 时使3 株菌的液体培养物变得清亮，而对照组菌液浑浊（图1B）。以上结果表明，噬菌体DS2 可体外裂解ETEC K88、K99 及987p 菌株。

图1 分别采用双层琼脂空斑试验（A）和与ETEC共增殖（B）检测DS2噬菌体对ETEC的体外裂解作用Fig.1 In vitro lysis of ETEC by DS2 phage was examined by double agar overlay plaque assay(A)and co-incubation with ETEC(B)

2.2 噬菌体对感染小鼠肝脏载菌量影响的检测结果 分别将不同浓度的DS2 噬菌体经腹腔注射小鼠1 h 后，对各组小鼠经腹腔注射0.2 mL的K88、K99及987p 混合菌液，于感染后12 h、24 h、48 h 分别检测各组小鼠肝脏载菌量。结果显示，高剂量组（1×109pfu/mL）小鼠的肝脏载菌量在感染后12 h、24 h较对照组有所升高，48 h 后下降，低剂量组小鼠肝脏的载菌量在感染后48 h 内较对照组均有所下降（图2），但以上各组差异均不显著（P＞0.05）。表明，噬菌体可以降低感染小鼠的肝脏载菌量，且低剂量组的效果优于高剂量组。

2.3 感染小鼠肝脏内噬菌体含量的检测结果 将上述注射不同浓度DS2 噬菌体的小鼠分别感染K88、K99 及987p 混合菌液并于感染后12 h、24 h、48 h，采用双层平板法检测各组小鼠肝脏噬菌体的含量。结果显示，对照组小鼠肝脏中均未检测到噬菌体。随着感染时间的延长，高、低剂量组小鼠肝脏噬菌体的含量均在下降，且在感染后48 h 内低剂量组小鼠肝脏噬菌体的含量均高于高剂量组（图3）。其中，在感染后24 h 时，低剂量组小鼠肝脏噬菌体的含量极显著高于高剂量组（P＜0.01）。表明，噬菌体在低剂量组小鼠体内的增殖能力优于高剂量组。

图3 各组小鼠肝脏噬菌体含量的检测结果Fig.3 Results of phage numbers in livers of mice in each group

2.4 各组小鼠血清细胞因子IL-1β 的检测结果 感染后24 h，分别采集每组各3 只小鼠的血清，利用ELISA 方法检测IL-1β 含量。结果显示，与对照组相比，高、低剂量组小鼠血清中的IL-1β 含量均有所下降（图4），且高剂量组与对照组间差异显著（P＜0.05）。表明，噬菌体可以使小鼠体内的炎性细胞因子IL-1β 含量下降，从而降低炎性反应，且高剂量组效果优于低剂量组。

图4 各组小鼠血清IL-1β含量的检测结果Fig.4 The serum IL-1β content test results of mice in each group

2.5 感染小鼠血浆内毒素的检测结果 感染后48 h，分别采集每组各3 只小鼠的血浆，利用试剂盒检测其中的内毒素含量。结果显示，高、低剂量组小鼠血浆内毒素的含量较对照组均有所升高（图5），且低剂量组与对照组间差异显著（P＜0.05）。表明，噬菌体可在小鼠体内裂解上述3 种ETEC，使其释放出内毒素，且低剂量组的裂解能力优于高剂量组。

图5 各组小鼠肝脏中内毒素含量的检测结果Fig.5 Liver endotoxin content test results of mice in each group

2.6 各组小鼠临床症状评分及存活率测定结果 对小鼠注射高、低剂量的噬菌体再感染K88、K99 及987p 混合菌液后，统计72 h 内各组小鼠的病死率并记录每组小鼠的平均体况得分。结果显示，对照组小鼠在感染后接近24 h 时的体况计分降至25 分以下，分数最低，高剂量组小鼠在感染24 h 后体况计分下降为70 分左右并持续至试验结束，而低剂量组小鼠在感染24 h 后体况计分一直维持在90 分以上。高、低剂量组及对照组小鼠的存活率分别为65%、95%及15%（图6、图7）。表明，噬菌体可以有效降低小鼠感染ETEC 后的死亡率，且低剂量组的防治效果优于高剂量组。

图6 各组小鼠体况计分统计结果Fig.6 Body condition score test results of mice in each group

图7 各组小鼠存活率的统计结果Fig.7 Survival rate test results of mice in each group

3 讨 论

耐药ETEC 引发的新生仔猪腹泻广泛存在于多个国家和地区，2017 年WHO 公布的最危急的耐药菌清单中就将超级耐药的大肠杆菌等列入其中[14]。噬菌体具有对细菌特异、高效、快速杀伤的特点，广泛应用于防治呼吸道、消化道、泌尿生殖道及表皮的感染[15-18]。

噬菌体在宿主体内的药代动力学规律与药物不同，且与宿主组织载菌量及治疗效果之间的确切关系尚未可知。当噬菌体的剂量很高时，大量的噬菌体吸附到细菌表面，不需要依赖于噬菌体的复制就可以杀死细菌，这种被动治疗条件下噬菌体在宿主体内不会有明显的增殖过程[19]；噬菌体在合适的浓度下，可以通过吸附并感染细菌释放裂解酶和穿孔素而裂解细菌，这种情况下噬菌体的杀菌过程就会伴随噬菌体数量的增加。本研究利用噬菌体DS2开展针对K88、K99、987p 感染小鼠的防治作用发现，在感染后24 h 及48 h，低剂量组小鼠肝脏噬菌体的含量极显著高于或高于高剂量组，且低剂量组小鼠的存活率和体况得分均高于高剂量组，提示低剂量噬菌体的治疗效果优于高剂量，推测这可能与低剂量噬菌体在宿主体内增殖并且发挥了杀菌作用而高剂量噬菌体仅发挥了快速的非增殖杀菌过程有关。

噬菌体裂解宿主菌后可引起细胞外膜层脂多糖（即内毒素）的大量释放[20]。本研究中预防组小鼠肝脏内毒素的含量较对照组均有所升高，与上述理论一致，但内毒素含量与动物死亡之间的规律还未知。另外，本研究结果显示，当被ETEC 侵染后，对照组小鼠炎性细胞因子IL-1β 含量升高，预防组则降低，说明噬菌体可降低宿主ETEC 带来的炎性反应。袭恒豫等利用噬菌体治疗乳腺炎分离菌株感染的小鼠时同样发现，噬菌体治疗组小鼠乳腺中的炎性细胞因子含量显著低于对照组[21]，也与本研究实验结果类似。

噬菌体通过特异识别宿主菌表面的脂多糖、外膜蛋白、鞭毛等结构侵入细菌体内并增殖，最终通过噬菌体产生的裂解酶和穿孔素等物质导致宿主菌的裂解，并释放子代噬菌体。噬菌体的杀菌过程高效、特异，无毒副作用。本研究结果表明噬菌体具有良好的体内外杀菌能力，可大幅度降低由ETEC 导致的小鼠死亡，为仔猪ETEC感染的防控提供了新思路。