金兰柚资源的遗传多样性及其亲缘关系分析

汤雨晴，闫承璞，杨惠栋，王雨亭，尹 峰，戴明辉，李乐宝，胡钟东，朱方红*

（1.江西省农业科学院 园艺研究所，江西 南昌 330200；2.安福县农业农村产业发展服务中心，江西 吉安 343000）

柚［Citrus maxima （Burm） Merr.］为芸香科柑橘属乔木，在我国南方地区广泛种植，其产业在地方经济发展中占据重要地位。金兰柚、金沙柚和桃溪蜜柚合称为井冈蜜柚［1］。金兰柚果肉脆嫩、味甜少酸、丰产性好，并且极耐储存［2］，被誉为“井冈蜜柚”之王，在江西省安福县广泛种植。金兰柚果实为卵圆形，果基部有短颈［3］，但在安福县栽培的金兰柚却存在近圆形、长椭圆形、葫芦形和扁圆形等果形，形态学差异很大。果农对其栽种的各种果形金兰柚来源并不清楚，是否存在同名异物或近似品种的情况也不得而知。

分子标记是在DNA分子水平上进行检测，不受生育阶段、外界环境等因子的影响，能客观、真实地反映品种间的差异。目前，分子标记技术已被广泛应用于柚类种质资源分析与亲缘关系鉴别。刘勇等［4］以33对SSR引物对110份柚资源和12份柚类近缘种进行遗传多样性分析，将金兰柚归类在沙田柚品系，且与金沙柚亲缘关系较近。陈巍等［5］利用SRAP标记对13份浙南柚类地方资源和琯溪蜜柚及芽变进行遗传多样性分析和鉴定。李先信等［6］采用形态学标记与SRAP分子标记技术，对分布于湖南特定生态条件下的47份地方柚类种质资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析，发现形态学标记与SRAP分子标记都能很好地将柚类品种进行分类，但SRAP标记所揭示的柚类种质间的遗传差异更准确。刘召亮等［7］针对江西省内不同来源的金沙柚种质及其近缘种质进行遗传多样性分析。目前，针对金兰柚果实形态差异对其进行分子层面解析的研究还没有。本试验收集安福县不同果形金兰柚，进行叶片形态观察和果实品质的测定，并开展分子标记鉴定，探究了不同果实形态下金兰柚生理品质和分子水平差异性，以期为安福县金兰柚品种鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

14份金兰柚材料采集自安福县，桃溪蜜柚和金沙柚采集自江西省农业科学院园艺研究所横岗基地（表1）。本试验所有样品采集后立即带回实验室，用双蒸水洗净后放入-80 ℃超低温冰箱中保存。

表1 所采集柚材料的来源信息

1.2 试验方法

1.2.1 叶片形态的观察 选择成熟的叶片采集回实验室，观察叶片的叶形、叶尖、叶基和翼叶形状。

1.2.2 果实品质的测定 用电子天平称量果实重量，游标卡尺测定果皮厚度和果实横纵经，果形指数=果实纵径（mm）/果实横径（mm），用手持数字折射仪测定可溶性固形物含量。所有数据均录入到Excel 2003软件，并对数据进行统计分析，借助SPSS 19.0软件利用邓肯氏新复极差法进行多重比较。

1.2.3 基因组DNA的提取 采用改良CTAB法提取样品DNA［8］，用NanoDrop 2000分光光度计测量其DNA浓度并统一稀释至50 ng/μg备用，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.4 InDel引物合成 根据金兰柚重测序数据，比对到晚白柚（website：http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php）参考基因组，筛选出27对扩增条带清晰，位点杂合的InDel（Insertion-deletion）引物，引物序列见表2。

1.2.5 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳 PCR反应体系为15 μL：7 mL的Mix液，0.3 μL 10 mmol/L的正向引物，0.3 μL 10 mmol/L的反向引物，1.5 μL 100 ng/μL模板DNA和6 μL ddH2O。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，Tm 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反应进行35个循环；最后72 ℃再延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳采用1.5%~2.0%质量百分比的琼脂糖凝胶，电压120 V，电泳15~20 min。

2 结果与分析

2.1 表型性状分析

2.1.1 叶片特征 安福县14份柚材料叶片特征如图1所示。14份柚材料叶片均有浅波状起伏，叶形从椭圆形至卵圆形到披针形，叶尖渐尖或钝形，叶基圆形或楔形，翼叶心形或狭长，总体而言，形态差异较大。虽然这14份样品叶形有差异，但均为单出复叶。

图1 安福县14份柚材料的叶片特征

2.1.2 果实品质特征 14份柚材料果实形状见图2。大部分样品果形为卵圆形（S6、S7、S9、S11），但也有部分样品果形为葫芦形（S2、S5）、近圆形（S3、S10、S14）等，果形差异很大。表2为14份柚样品果实品质分析结果。从表2可以看出，这14份柚样品在单果重、果实横径、果实纵径、果皮厚度、可溶性固形物含量上均存在显著差异。单果重为333.75~1020 g不等；果形指数最小的接近1，近似于圆形，最大的可达到1.22；果皮厚度最薄只有10 mm，但最厚的可达到15.99 mm。可溶性固形物含量在11.45~15.00之间，不同果园采摘的柚果实可溶性固形物含量差异较大，同一果园采摘的柚果实可溶性固形物含量差异也很大。

图2 安福县14份柚材料的果实特征

表2 27对InDel标记引物序列

2.2 16份柚材料遗传多样性分析

27对引物扩增结果见图3。结果显示，试验所用27对引物共扩增出54个清晰可辨的位点，平均条带数为2，InDel标记片段的分子量主要集中在250~500 bp。这27个标记中，22个标记表现出位点多态性，多态率达到81.48%。这22对标记能明显区分金兰柚、桃溪蜜柚和金沙柚，但安福县采集的14份柚材料在所有标记扩增条带中均无差异。

图3 InDel引物在16份柚材料中的PCR扩增结果

3 讨论

分子标记技术是以个体间核苷酸序列差异为基础的标记，在植物遗传多样性的研究当中，目前已有SRAP［5-6］、SSR［4，7］、RAPD［9］、ISSR［10］等分子标记技术得到了成功的应用。InDel标记在柑橘种属分类中已有应用［11］，但在柚类种质资源遗传分析中尚未应用。刘勇等［12］发现江西的柚类资源主要由沙田柚品种群、果实梨形或卵形的金兰柚及其后代等品种群、杂种柚品种群组成，遗传多样性非常丰富。

本研究采用InDel标记分析安福县14份金兰柚样品，并以桃溪蜜柚、金沙柚为对照，结果显示：14份金兰柚材料几乎无遗传学上的差异，但与金沙柚、桃溪蜜柚存在显著差异。从分子水平上看，这14份样品应均为金兰柚。样品S9为安福县第一批金兰柚树，当地人称之为金兰柚母树，已栽培近40年，安福县大规模发展金兰柚时曾经作为优良母株提供接穗。S9果形为卵圆形，果基部有短颈，符合文献上对金兰柚的描述［3］，S10与S9采摘自同一果园，果形为近圆形，但分子标记未显示出差异性，推测S10应为S9的芽变，但只是发生了点突变，使用分子标记很难将其区分，应开发更加精确的分子标记或者对其基因组测序以准确判断碱基突变位点。

本研究选择安福县6个具有代表性果园进行样品采集，共收集金兰柚样品14份。果实品质分析结果显示，不同果园金兰柚果实大小和单果重差异较大，但同一果园差异较小，这一性状受果园栽培管理措施的影响较大，可能与栽培者管理水平有关［13］。可溶性固形物含量在不同果园间存在差异，在同一果园内，如安福县横龙镇乐谷村鼎盛生态农业有限公司采摘的2个样品S5、S6可溶性固形物含量差异较大，这可能与采摘样品环境（山上、山下）或者管理水平不一致有关［14］。果形性状为受多基因控制的数量性状［15］，属于较稳定的遗传性状，一般受环境等影响较小，本试验证明金兰柚在分子水平上无明显差异，但形态学相关分析可将14份金兰柚材料粗分为梨形和偏圆形2种果形，可能由于表观因素影响，需要进一步研究。本研究采用形态学标记和分子标记对14份金兰柚进行遗传多样性分析，探究了不同果实形态下金兰柚品质和分子差异，得出卵圆形和近圆形果形均为金兰柚，本研究为安福县金兰柚品种鉴定提供了一定参考。

表3 安福县14份柚材料果实的品质分析