苦瓜苗期耐热性综合评价及其鉴定指标的筛选

陈中钐，杜文丽，许端祥，高 山*，林碧英

（1.福州市蔬菜科学研究所，福建 福州 350111；2.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002）

近年来，随着全球气候变暖，极端高温天气频发，高温热害已成为影响作物生长的一个重要环境因子［1］，苦瓜（Momordica charantia L.）性喜温暖，较耐热而不耐寒，但不同苦瓜种质资源耐热能力差异明显，对于育种工作者而言，快速、准确地开展苦瓜种质资源耐热性的鉴定和评价，能有效地减少育种盲目性，提高育种效率，缩短育种周期。因此，开展苦瓜种质资源耐热性鉴定和评价具有十分重要的意义。目前，已有学者从生理特性、农艺性状等方面开展了苦瓜耐热性的鉴定及评价指标的筛选等研究，郭培国等［2］研究表明，电解质渗透率、丙二醛含量、叶绿素含量、叶绿素荧光参数Fv/Fm等与耐热性相关的生理指标可用于苦瓜耐热性评价。郑岩松［3］、李家明［4］等通过调查夏季高温环境下苦瓜植株田间表现，筛选出与苦瓜耐热性相关的农艺性状指标。曾晶等［5］研究结果表明：产量、商品果数和单果重的变化率可作为苦瓜成株期耐热性强弱的鉴定指标。

大多数学者认为，植物耐热性的遗传是由多对基因控制的数量性状，且不同植物耐热机制不同，相关研究表明，苦瓜苗期耐热性的遗传是受2对加性—显性—上位性主基因控制［6］，因此仅通过单一指标无法准确地鉴定和评价苦瓜的耐热性，需要从众多指标中筛选出若干重要指标，建立可靠的数学模型进行耐热性综合评价，而综合评价法是将主成分分析、隶属函数分析和聚类分析这3种方法相结合，可综合反映植物的耐热能力，此方法已经在棉花［7］、黄瓜［8］、大白菜［9］、番茄［10］、茄子［11］等作物的耐热性评价中广泛应用，但针对苦瓜苗期耐热性评价的研究鲜见报道。

本研究以20份苦瓜自交系为材料，测定高温胁迫下苦瓜苗期13项生理生化和光合特性指标，采用多元统计分析方法开展了苦瓜的耐热性综合评价，并建立了苦瓜苗期耐热性评价数学模型，以期为苦瓜种质资源耐热性的鉴定和评价，以及为耐热苦瓜新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为经多年田间观察，耐热性差异显著的苦瓜高代自交系20份，均由福州市蔬菜科学研究所苦瓜课题组提供，20份苦瓜自交系的来源和主要形态、生物学特征参考《苦瓜种质资源描述规范和数据标准》［12］展开调查，调查结果见表1。

表1 各苦瓜自交系的来源、主要形态和生物学特征

1.2 试验处理

将20份苦瓜自交系点播于50孔穴盘中，置于人工气候室28 ℃恒温催芽，待种子破土后，设置昼夜温度28 ℃/18 ℃，光照强度5000 lx，光周期12 h，相对湿度为70%，待2片真叶展开时，移栽至直径8 cm的营养钵内进行常规培养，培养基质配比为泥炭∶蛭石∶珍珠岩=7∶2∶1（v∶v∶v），培养环境同上，待苗长至3叶1心期时，选择长势一致的幼苗置于人工气候室内38 ℃恒温胁迫，设置光照强度5000 lx，光周期12 h，相对湿度为70%，每份材料8株，设3次重复，随机区组排列，高温胁迫72 h后进行相关参数测定，以常规培养（昼夜温度28℃/18 ℃）72 h的苦瓜幼苗作对照。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生理指标的测定 参照李合生［13］的实验方法，采用丙酮提取法测定叶绿素（Chl）含量、硫代巴比妥酸法（TBA）测定丙二醛（MDA）含量、电导仪测定相对电导率（REC）、氮蓝四唑法（NBT）测定超氧化物岐化酶（SOD）活性、愈创木酚显色法测定过氧化物酶（POD）活性、紫外光吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性、磺基水杨酸提取法（SA）测定游离脯氨酸（Pro）含量、羟胺氧化法法测定超氧阴离子自由基（O2-·）含量、硫酸钛比色法测定过氧化氢（H2O2）含量。

1.3.2 光合指标的测定 净光合速率的测定：使用LI-6800型便携式光合作用测定仪（美国LICOR公司）测定苦瓜叶片净光合速率（Pn），选择苦瓜植株从基部向上数第3片功能叶于早上9:00~11:00进行测量，每个材料测定3次，结果取平均值。

叶绿素荧光参数的测定：使用LI-6800型便携式光合作用测定仪测定苦瓜叶片叶绿素荧光参数，测定前植株暗处理30 min，选择苦瓜植株从基部向上数第3片功能叶进行测量，每个材料测定3次，结果取平均值，测定指标包括初始荧光（Fo）、最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据统计与分析，SPSS 22.0软件进行相关分析、主成分分析与聚类分析。

耐热系数（heat-tolerance coefficient，HTC）：

各综合指标的隶属函数值：

式（2）中，Xj表示第j个综合指标值；Xmax表示第j个综合指标的最大值，Xmin表示第j个综合指标的最小值。

各综合指标的权重：

式（3）中，Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的权重，Pj为各品种第j个综合指标的贡献率。

综合耐热性评价值：

式（4）中，D为不同苦瓜自交系在高温胁迫下由综合指标评价所得的耐热性综合评价值。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的耐热系数及相关性分析

由表2可知，不同苦瓜自交系经高温胁迫后，其POD、SOD、CAT、Pro、O2-·、H2O2与对照相比均不同程度上升（HTC＞1），而Chl、Pn、Fv/Fm、ΦPSⅡ与对照相比均不同程度下降（HTC＜1），MDA、REC、Fo在各材料间的耐热系数表现不一致，有的上升，有的下降。从变异系数可以看出，CAT、H2O2变异系数排在第1位、第2位，分别为35.261%和33.959%，ΦPSⅡ的变异系数为14.259%，在所有13项指标中变异系数最小，表明高温胁迫对苦瓜叶片的CAT、H2O2影响较大，对ΦPSⅡ的影响较小。由于同一材料不同单项指标以及同一指标不同材料的耐热系数变化不尽相同，因此难以根据单一指标的耐热系数判断材料耐热性强弱。

表2 不同苦瓜自交系的各项指标耐热系数

相关分析结果表明（表3），各单项指标与其他指标间至少存在1个或多个显著相关或极显著相关，其中，抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT）两两之间呈极显著正相关；光合指标（Pn、Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ）两两之间呈极显著相关；MDA、Pro均与O2-·、H2O2呈极显著正相关；REC与光合指标（Pn、Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ）呈极显著正相关；Chl与REC、Pn、Fo、Fv/Fm呈极显著相关；O2-·与H2O2呈极显著正相关。由于各单项指标之间的耐热系数存在不同程度的相关性，造成它们所提供的信息发生重叠，表明苦瓜耐热性是一个复杂的综合性状，单一指标不能准确地评价苦瓜的耐热性，因此，需要利用多元统计方法进行分析和评价。

表3 各单项指标的相关系数矩阵

2.2 主成分分析

对13个单项指标的耐热系数进行主成分分析，选取特征值大于1的主成分，结果显示，13个单项指标转化成4个主成分（表4），贡献率分别为44.735%、18.491%、14.553%、9.479%，累积贡献率87.258%，表明这4个主成分能够包含本试验所有13个耐热性评价指标的绝大部分信息。

表4 各性状的主成分系数和贡献率

从各项指标特征向量可以看出，第1主成分（CI1）贡献率为44.735%，主要由Chl、REC、Pn、Fo、Fv/Fm构成，可称为光合和相对电导率因子；第2主成分（CI2）贡献率为18.491%，主要由MDA、O2-·、H2O2构成，可称为活性氧和丙二醛因子；第3主成分（CI3）贡献率为14.553%，主要由POD、SOD、CAT构成，可称为抗氧化酶因子；第4主成分（CI4）贡献率为9.479%，主要由Pro构成，可称为脯氨酸因子。

2.3 综合评价

2.3.1 隶属函数分析 根据公式（2）分别计算20个苦瓜自交系4个综合指标的隶属函数值（表5），隶属函数值的范围在同一综合指标中介于0.000~1.000之间，如果某一材料隶属函数值为0.000，表明该材料在对应的综合指标中耐热性表现最弱，如果其隶属函数值为1.000，表明该材料在对应的综合指标中耐热性表现最强。由表5可知，T9、T13、T14、T19分别对应综合指标u（X1）、u（X2）、u（X3）、u（X4）的隶属函数值为1.000，表明其在对应的综合指标耐热性表现最强，而T19、T5、T19、T8分别对应综合指标u（X1）、u（X2）、u（X3）、u（X4）的隶属函数值为0.000，表明其在对应的综合指标耐热性表现最弱。

2.3.2 权重确定 将4个综合指标的贡献率代入公式（3）中计算得到4个综合指标的权重分别为0.513、0.212、0.167、0.109（表5）。

2.3.3 综合评价 运用公式（4）计算各苦瓜自交系综合耐热评价值D（表5），并根据D值的大小对各材料耐热性强弱进行排序。结果表明，20个苦瓜自交系耐热性由强到弱排序依次为T9＞T13＞T10＞T17＞T14＞T8＞T7＞T4＞T16＞T11＞T2＞T6＞T15＞T12＞T 18＞T3＞T1＞T19＞T20＞T5。

表5 各苦瓜自交系的综合指标值、权重、u（Xj）、D值和综合评价

2.4 不同苦瓜自交系耐热性的聚类分析

采用欧氏距离，离差平方和法对各苦瓜自交系的综合耐热评价值（D值）进行聚类分析（图1），在综合评价值距离为6.1的位置，将20个苦瓜自交系根据耐热能力强弱划分为3类。第Ⅰ类为强耐热型，共5个材料，分别为T9、T10、T13、T14、T17；第Ⅱ类为中耐热型，共14个材料，分别为T1、T2、T3、T4、T6、T7、T8、T11、T12、T15、T16、T18、T19、T20；T5归为第Ⅲ类，属于弱耐热型材料。

图1 20个苦瓜自交系的D值聚类图

2.5 逐步回归分析及耐热性鉴定指标的选择

为进一步分析各指标与耐热性之间的关系，筛选苦瓜苗期耐热性鉴定指标，分别以各单项指标的耐热系数和耐热性综合评价值作为自变量和因变量进行逐步回归分析，获得回归方程：D=-0.650+0.143SOD+0.352Chl+0.088MDA-0.149 REC+0.102H2O2+0.846Fv/Fm，方程决定系数R2=0.991。由回归方程可知，13个单项指标中有6个指标对苦瓜苗期耐热性有显著影响，分别是SOD、Chl、MDA、REC、H2O2、Fv/Fm，将这6个指标的耐热系数代入回归方程中对各苦瓜自交系耐热性进行预测，结果表明（表6），各苦瓜自交系D值估计精度均在93.04%以上，平均估计精度96.92%，表明该方程适用于苦瓜苗期耐热性评价。

表6 回归方程估计精度分析

3 讨论

高温是植物生长发育过程中最常遭受的环境胁迫因子之一［14］，植物在高温胁迫下，其内部生理机制会发生一系列诸如细胞膜透性增大［15-16］，叶绿素降解［17］，活性氧含量增加［18-19］，抗氧化酶活性升高［20］，叶片光合作用受到抑制［21］等复杂的连锁反应。国内外众多学者已筛选出与植物耐热性密切相关的众多表型性状、生理生化、光合特性等指标，但不同指标对高温胁迫的响应程度不同，因此，需要运用多元分析方法对植物耐热性进行综合评价，建立准确、可靠的耐热评价体系。

本研究通过因子分析将13个生理生化和光合特性指标转换为4个新的彼此独立的综合指标，4个综合指标累积贡献率达87.258%，并进一步通过隶属函数和聚类分析将20个参试材料，根据其耐热能力的大小分为强耐热、中耐热、弱耐热3种类型。5个强耐热类型苦瓜自交系中，T9、T13、T10都来源广东，T14、T17来源我国台湾省，均是近年来收集的耐热性表现突出的优良品种，经多代定向选择而育成的稳定自交系，其中T9在田间表现为叶片厚、叶色深绿、在夏季高温环境下生长势强、坐果性好且生育期长，在南方地区能正常越夏；而弱耐热类型苦瓜自交系T5来源重庆市，田间表现极早熟、连续坐果能力强，耐低温不耐高温，在夏季高温环境下生长受阻、畸形瓜多、易早衰，定位为早春设施栽培材料。由此可见，本研究中各苦瓜自交系聚类分析结果与田间表现基本一致。

本研究通过逐步回归分析建立了苦瓜苗期耐热性评价回归方程：D=-0.650+0.143SOD+0.352 Chl+0.088MDA-0.149REC+0.102H2O2+0.846Fv/Fm，平均估计精度为96.92%，表明该方程可用于苦瓜苗期耐热性评价，从回归方程中筛选出6个显著影响苦瓜苗期耐热性评价的单项指标可替代本研究调查的13个生理生化指标，能运用于苦瓜种质资源耐热性快速鉴定，从而提高苦瓜耐热性鉴定效率。从各单项指标的耐热系数（表2）可知，强耐热型苦瓜自交系在高温胁迫下Chl、Pro、Fv/Fm均维持在较高水平，而REC变化较小，推测强耐热类型苦瓜自交系的幼苗叶片在高温胁迫下通过积累更多的Pro，以调节细胞渗透压，保护细胞膜结构免受高温胁迫的影响，同时叶绿素合成受抑制程度较低，光合作用能维持在较高水平，这与郭培国［2］、毛静［22］、吴震［23］等的研究结果相一致。

4 结论

本 研 究 筛 选 出SOD、Chl、MDA、REC、H2O2、Fv/Fm等6个显著影响苦瓜苗期耐热性评价的单项指标，为苦瓜苗期耐热性鉴定和评价提供了理论依据，但在苦瓜耐热评价过程中仍需要综合考虑田间农艺性状、产量性状等其他指标的影响，以提高综合评价的准确性。筛选出T9、T10、T13、T14、T17等5个强耐热类型苦瓜自交系，可作为耐热苦瓜新品种选配的亲本材料。