紫外分光光度法测定艾叶多糖含量方法学考察*

方 晋，朱平平，彭慧倩，覃智恒，刘育文，彭 颖

(南华大学药学院，湖南 衡阳 421001)

艾叶，为菊科蒿属植物艾ArtemisiaargyiLevl.etVant.的叶，味辛、苦，性温，有温经止血、祛湿止痒、散寒止痛等功效[1]。艾叶广泛分布于亚洲东部，全草入药，是我国传统的预防鼠疫、炎症、癌症、痛经等疾病的中草药[2-3]。此外，艾叶还可用于艾灸、驱赶蚊虫，用艾水洗澡或熏蒸可止痒消毒、防治皮肤病[4]。现代药理研究表明，艾叶的主要化学成分为多糖、黄酮、挥发油及三萜类，药理作用较广[5-6]。其中，艾叶多糖具有抗菌消炎、抗氧化、免疫调节等作用，具有广泛的应用前景[7-8]。本文通过单因素考察，对苯酚-浓硫酸法测定艾叶多糖含量的显色条件进行了优化，并进一步探究了紫外分光光度法测定艾叶多糖含量的可行性，可为后续艾叶多糖的提取研究和开发利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

FA224电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-2450紫外分光光度计，岛津企业管理有限公司；SY-1220恒温电热水浴锅，美国精骐有限公司。

艾叶，湖北蕲阳河蕲艾科技有限公司；葡萄糖标准品，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇，湖南汇虹试剂有限公司；苯酚，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸，湖南汇虹试剂有限公司；纯净水，实验室自制。

1.2 试液配制

1.2.1 艾叶供试品试液的配制

精密称取粉碎后的艾叶粉末5 g置于圆底烧瓶内，按料液比1:25加入125 mL 40%的乙醇溶液，加热至91 ℃保持微沸状态回流2 h，趁热抽滤，滤液倒入具塞锥形瓶内，置于冰箱备用。移取以上艾叶提取液1 mL，放置于25 mL容量瓶中，使用纯净水稀释定容，作为艾叶供试品试液。

1.2.2 葡萄糖标准品试液的配制

精密称取葡萄糖标准品0.0113 g置于50 mL容量瓶中并加入纯净水定容，作为葡萄糖标准品试液。

1.3 苯酚-浓硫酸法测定艾叶多糖含量的最适条件考察

1.3.1 苯酚-浓硫酸法

精密移取稀释后的艾叶供试品试液1.0 mL，放于20 mL的具塞比色管中，加入纯净水补至2 mL。同时加入5%的苯酚溶液1.0 mL，快速振荡均匀，后迅速沿管壁加入浓硫酸7 mL，静置10 min后置于40 ℃水浴锅中加热30 min，取出后迅速冰浴3 min，再保持在室温下静置30 min，用紫外分光光度计测定吸光度值[9-10]。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 取样量考察

艾叶供试品试液取样量分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mL，其他操作同“1.3.1”。实验表明，取样量为1.0 mL时吸光度为0.289，在0.2～0.8之间可满足朗伯比尔定律紫外吸光度测定要求，故艾叶供试品取样量可定为1.0 mL。

表1 取样量考察

1.3.2.2 苯酚用量考察

5%苯酚用量分别取0.4、0.7、1、1.3、1.6 mL，其他操作同“1.3.1”。结果表明，苯酚取1.0～1.3 mL时，吸光度数据接近。为节省苯酚用量，可选用1.0 mL作为适宜的苯酚用量。

图1 苯酚用量考察

1.3.2.3 浓硫酸用量考察

浓硫酸用量分别取5、6、7、8 mL，其他操作同“1.3.1”。实验表明浓硫酸用量为7 mL、8 mL时吸光度A数据接近，为节省硫酸用量，适宜的硫酸用量选用7 mL。

图2 浓硫酸用量考察

1.3.2.4 水浴温度考察

水浴温度分别为20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃，其他操作同“1.3.1”。实验表明水浴温度为40 ℃时为宜。

图3 水浴温度考察

1.3.2.5 水浴时间(反应时间)考察

水浴时间分别为10、20、30、40、50 min，其他操作同“1.3.1”。实验表明水浴时间对实验结果影响并不大，故可选用20 min作为反应时间。

图4 水浴时间考察

1.3.2.6 静置状态考察

通过查阅药典以及文献可知，水浴后有迅速冰浴降至室温以及在室温下冷却两种方法，本研究据此进行考察，其他操作同“1.3.1”。实验表明冰浴或室温冷却的吸光度值数据接近，但为防止季节性室温不同的干扰，选用冰浴条件可以控制实验条件的一致性。

表2 静置状态考察

1.3.2.7 紫外检测前最短等待时间考察

根据预实验以及查阅文献后可知，在冰浴冷却后的30 min内，溶液能够逐渐变得澄清，吸光度变化较大[11]。故本研究考虑存在紫外检测前最短等待时间这一影响因素，并设计了以下考察试验。

冰浴后分别在室温下静置10、20、30、40、50 min，其他操作同“1.3.1”。实验表明冰浴后等待30 min以上吸光度A趋于稳定，故冰浴后适宜等待30 min，再于紫外分光光度计下进行吸光度A的测定。

图5 紫外检测前最短等待时间考察

1.3.2.8 产物稳定性(紫外检测前最长等待时间)考察

苯酚-浓硫酸法作用原理为生成橙黄色化合物的显色反应[12]。而产物稳定性考察是为了探究从冰浴结束到利用紫外分光光度计测定吸光度的最长时间。如果产物在一定时间内发生降解变质等反应，则需要控制最迟测定时间，以避免实验误差的产生。

分别在冰浴结束1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后，利用紫外分光光度计测定吸光度A值，其他操作同“1.3.1”。根据实验数据可知，显色反应产物在4 h内稳定，故应该控制反应后4 h内于紫外分光光度计下测定吸光度A值。

图6 紫外检测前最长等待时间考察

1.3.3 总结苯酚-浓硫酸法测定艾叶总多糖最优实验条件

综上所述，处理艾叶多糖的最优显色条件为：精密移取稀释后的艾叶供试品试液1.0 mL，放于20 mL的具塞比色管中，加入纯净水补至2 mL。同时加入含量为5%的苯酚溶液 1.0 mL，快速振荡均匀，后迅速顺着管壁加入浓硫酸7 mL，静置10 min后置于40 ℃水浴锅中加热20 min，取出后迅速冰浴3 min，再保持在室温下静置30 min，并应在冰浴结束4 h内，用紫外分光光度计测定吸光度值。

1.4 紫外分光光度法测定艾叶总多糖含量系统方法学考察

1.4.1 专属性考察

分别对空白试剂(纯净水)、葡萄糖标准品试液、艾叶供试品试液，按“1.3.3”项下最适苯酚-浓硫酸法进行显色，同时取未经显色处理的艾叶供试品试液，利用紫外可见分光光度计在600～200 nm波长范围内对上述四种试液进行光谱扫描，结果为图7所示，选择葡萄糖标准品的最大吸收波长487 nm作为本系统方法学考察的测定波长。

图7 专属性考察光谱图

1.4.2 线性范围考察

分别依次移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖标准品试液于20 mL具塞比色管中，按“1.3.3”项下最适苯酚-浓硫酸法进行显色。用空白试液调零，在波长487 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线。由图8可得，本实验条件下线性回归方程为y=1.5764x+0.0145，r=0.9996，表明葡萄糖浓度在22.6～226 μg/mL范围内与吸光度值的线性关系良好。

图8 线性范围标准曲线图

1.4.3 精密度考察

艾叶供试品精密度考察的平均吸光度值为0.339(n=6)，RSD=0.15%，表明本实验仪器精密度非常好。

1.4.4 重复性考察

艾叶供试品重复性考察的平均吸光度值为0.345(n=6)，RSD=1.66%，可知该方法重复性良好。

1.4.5 加样回收试验

平行移取6份0.5 mL艾叶供试品试液，分别精密加入葡萄糖标准品试液0.1 mL并按“1.3.3”项下最适苯酚-浓硫酸法进行处理，可得平均吸光度值为0.347(n=6)，加样回收率平均值为97.63%，RSD=1.67%，故表明本方法的加样回收率较好。

1.4.6 稳定性考察

分别于1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后对新配制的艾叶供试品试液按“1.3.3”项下最适苯酚-浓硫酸法进行显色处理并测定吸光度A值，计算可得稳定性考察的平均吸光度值为0.352(n=6)，RSD=1.43%，表明艾叶供试品试液在24 h内比较稳定。

2 结 论

苯酚-浓硫酸法是多糖含量测定中的普遍使用的显色方法。其原理为：在浓硫酸的作用下，多糖可以水解变为单糖，后者能够迅速脱水，形成糠醛衍生物，生成的糠醛衍生物可与苯酚发生显色反应，从而形成橙黄色化合物[12]。该物质颜色稳定，且一定浓度范围内，多糖含量(浓度)与吸光度值成线性正比，可用比色法测定。

根据对苯酚-浓硫酸法最适反应条件考察可知：①为保证苯酚-浓硫酸法处理多糖时的显色产物稳定，应在30 min至4 h内利用紫外分光光度计进行测定；②具塞比色管体积应超过反应溶液总体积两倍以上，以避免由于液体混合不匀所造成的误差；③操作中的每一步均应该充分振荡，控制操作手法尽量一致；④在加入浓硫酸后，应该在室温下静置10 min，后再于水浴锅中加热。

根据紫外分光光度法对艾叶多糖含量测定系统方法学考察可知：以纯净水为空白，以葡萄糖标准品为对照且取样量为0.2 mL，艾叶供试品取样量为1 mL，采用上述苯酚-浓硫酸法最佳显色条件处理试液，在波长487 nm处，用紫外分光光度计测定艾叶多糖含量。本方法专属性强，简单易操作，重复性较好，稳定可靠，可满足对艾叶多糖含量测定的要求。