止得咳颗粒止咳作用研究

梁 洁 ，陈辉华 ，信晨曦，唐云丽，姜 枫，陈日兰，郑飘雪 ，陈 俊*

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；3.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

咳嗽是临床上比较常见的症状，多由呼吸系统疾病引起，该症状在学龄前期及学龄期儿童中尤为多见［1］。剧烈、频繁的咳嗽会影响到人们的正常生活，需给予必要处理，如存在炎症还需进行抗炎治疗。咳嗽的主要发病机制尚未完全清楚，目前认为主要与细胞免疫失衡、气道慢性炎症的形成有关［2］。镇咳药物作用机制主要分为中枢性镇咳（直接抑制咳嗽中枢）和外周性镇咳（抑制咳嗽反射其他环节）两类：中枢性镇咳作用主要是通过某些神经递质来完成，单胺类5-HT 是中枢性镇咳作用机制的一个重要组成部分，该类镇咳药物可通过与5-HT 受体相互作用，促进中枢5-HT 释放而达到镇咳效果［3-5］；外周性镇咳机制中则以抗炎和局部保护作用为主［6］。咳嗽在临床上主要是对症处理，如抗生素、镇咳药等是常用的药物［7］，这些药物存在维持时间短暂、易造成病情反复及不良反应常见等缺陷。中医药注重标本兼治，在治疗咳嗽方面积累了大量的经验。中药复方制剂止得咳颗粒为临床经验方，由龙脷叶、射干、桔梗、白前、黄芩、青天葵、枇杷叶、薄荷、荆芥、柴胡等10 味药材科学配伍组成，主治外感咳嗽，具有宣肺、止咳、化痰、利咽的功效，用于上呼吸道感染以及急、慢性支气管炎。该方临床疗效显著、副作用少、安全低毒［8］。课题组前期研究发现止得咳颗粒具有一定的抗炎作用［9］。基于此，本实验开展针对止得咳颗粒止咳方面的研究，以评价止得咳颗粒的镇咳作用，并探讨其作用机制，以期为该复方制剂的开发应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级昆明种（KM）小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002。于广西中医药大学实验动物中心饲养，饲养条件：清洁Ⅱ级，温度18～22 ℃，相对湿度50%。实验前适应性喂养3 d。

1.2 试剂与药物 止得咳颗粒由广西中医药大学附属瑞康医院制剂室生产（批号：20190701；每袋10 小包，每包15 g），由桔梗、白前、龙脷叶、枇杷叶、青天葵、射干、柴胡、黄芩、荆芥、薄荷等10味中药组成；磷酸可待因片（青海制药厂有限公司，批号：20180433）；氨水（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160322；分析纯）；小鼠5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、去甲肾上腺素（NE）、P 物质酶联免疫分析试剂盒（北京康普同创生物技术有限公司生产，批号20191012）。

1.3 主要仪器 WH-2000 超声波雾化器（广东粤华医疗器械厂）；SIM-F140AY65-PC 制冰机（日本大阪松下电器）；ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；LHS-250SC 恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器）；离心机，超低温冰箱。

2 方 法

2.1 氨水引咳实验 取KM 小鼠60 只，雌雄各半，按体质量随机分为正常组、模型组、磷酸可待因组（0.011 g/kg）及止得咳颗粒高、中、低剂量组（1.137 g/kg、2.275 g/kg、4.550 g/kg，临床用量按体质量换算成小鼠等效剂量作为高剂量［9］），每组10只。灌胃给药，给药量20 ml/kg，每天1 次，连续7 d，空白组与模型组灌服等体积纯化水。末次给药后1 h，予浓氨水喷雾20 s（正常组除外），喷雾终止后，立即取出小鼠，记录2 min内小鼠的咳嗽次数和潜伏期。各组小鼠眼眶取血，取出脑和肺组织，生理盐水除去血液，放入离心管，加入PBS，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 指标检测 运用酶联免疫分析（ELISA）试剂盒检测小鼠脑组织中5-HT、5-HIAA、NE水平，以及血清与肺组织中P 物质水平。根据试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算各指标浓度。

2.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件对实验结果进行分析，正态计量数据用均数±标准差（）表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 止得咳颗粒对小鼠咳嗽的影响 与模型组比较，止得咳颗粒各剂量组和磷酸可待因组均可延长小鼠咳嗽潜伏期并减少小鼠2 min 内咳嗽次数，其中止得咳颗粒中、高剂量组及磷酸可待因组小鼠咳嗽潜伏期显著延长（P＜0.01），咳嗽次数显著减少（P＜0.01）。结果显示，随着止得咳颗粒剂量的增加，小鼠咳嗽潜伏期逐渐延长，咳嗽次数逐渐减少，说明止得咳颗粒对氨水引起的咳嗽有抑制作用且呈现一定的量效关系，其止咳作用随剂量增加而增强。结果见表1。

表1 止得咳颗粒对小鼠咳嗽的影响 （）

表1 止得咳颗粒对小鼠咳嗽的影响 （）

注：与模型组比较，①P＜0.01

组 别模型组磷酸可待因组止得咳颗粒低剂量组止得咳颗粒中剂量组止得咳颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10剂量（g/kg）—0.011 1.137 2.275 4.550咳嗽潜伏期（s）45.83±19.43 63.83±13.29 ①57.91±22.72 64.58±17.09①66.00±24.85①2 min内咳嗽次数（次）17.33±11.97 3.75±2.22①12.33±3.11 5.83±2.59①5.25±1.71①

3.2 止得咳颗粒对小鼠脑组织中中枢神经递质的影响 与正常组比较，模型组小鼠脑组织中5-HT、5-HIAA、NE含量均有所降低，其中5-HT含量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，止得咳颗粒高剂量组和磷酸可待因组小鼠脑组织中5-HT、5-HIAA、NE 含量显著增高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表2。

表2 止得咳颗粒对小鼠脑组织中5-HT、5-HIAA、NE水平的影响 （）

注：与正常组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别正常组模型组磷酸可待因组止得咳颗粒低剂量组止得咳颗粒中剂量组止得咳颗粒高剂量组n 剂量（g/kg）10 10 10 10 10 10— —0.011 1.137 2.275 4.550 5-HT（ng/L）947.40±280.22 686.66±127.69①891.61±223.56②820.48±131.46 865.49±183.46 880.49±220.55②5-HIAA（ng/L）58.45±6.59 47.36±1.67 71.08±6.02③57.32±4.68 62.25±5.19 68.17±1.65②NE（ng/L）716.25±31.88 656.32±31.95 802.53±52.50②624.19±40.49 733.39±36.27 775.99±35.13②

3.3 止得咳颗粒对小鼠血清、肺组织中P 物质（SP）水平的影响 与正常组比较，模型组血清及肺组织中SP含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，止得咳颗粒中、高剂量组和磷酸可待因组小鼠血清及肺组织中SP含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表3。

表3 止得咳颗粒对小鼠血清、肺组织中SP水平的影响 （）

表3 止得咳颗粒对小鼠血清、肺组织中SP水平的影响 （）

注：与正常组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别正常组模型组磷酸可待因组止得咳颗粒低剂量组止得咳颗粒中剂量组止得咳颗粒高剂量组n 剂量（g/kg）10 10 10 10 10 10— —0.011 1.137 2.275 4.550血清SP（ng/L）3 788.16±209.68 4 927.85±253.62①3 519.74±542.32③4 886.18±272.33 4 556.14±211.95②4 072.59±311.77③肺组织SP（ng/L）3 488.16±299.68 3 915.79±419.66①3 318.75±431.97③3 687.99±158.48 3 597.53±252.78②3 514.47±234.48②

4 讨 论

现有的镇咳药主要是中枢性或外周性镇咳药，虽种类繁多，但存在疗效不佳、副作用大、作用范围窄等不足［10］。止得咳颗粒是一种纯中药复方制剂，方中龙脷叶性平，味甘、淡，入肺经，具清热化痰、止咳平喘之功；射干味苦，性寒，具有清热解毒、消痰、利咽之功效，亦归肺经，二者共为君药；桔梗辛散苦泄，归肺经，善于开宣肺气、祛痰利气；白前味辛、苦，性微寒，长于降气化痰；二者协同，一宣一降，以复肺气之宣降，增强君药宣肺止咳之力；黄芩清肺泻火，桔梗、白前共为臣药；青天葵清肺止咳、散瘀消肿；枇杷叶清肺止咳，祛痰平喘；荆芥、薄荷疏风解表，祛邪利咽；柴胡和解表里，退热；五者均为佐使之用。诸药合用，使上焦风热得以疏散，肺气得以宣降则咳嗽止［9］。

本研究通过氨水引咳模型探讨止得咳颗粒的镇咳作用和机制，结果显示，止得咳中、高剂量组和磷酸可待因组均可显著延长小鼠咳嗽潜伏期并减少小鼠2 min内咳嗽次数（P＜0.01），随着止得咳剂量的增加，小鼠咳嗽潜伏期逐渐延长，咳嗽次数逐渐减少，提示止得咳颗粒对氨水引起的咳嗽有抑制作用且呈现一定的量效关系。

止咳药物镇咳的药理作用机制至今尚不明确，有研究认为可能与阻滞NM-DA受体［11］、激动σ-1［12］和5-HT1B/D［13］等受体作用相关。在临床前研究特定的咳嗽模型中，以上受体的选择性配体可独立展现出镇咳作用，而后2 种受体的药理性拮抗剂可阻断右美沙芬的镇咳作用［14］。5-羟色胺（5-HT）广泛存在于哺乳动物组织，在大脑皮层及神经突触内含量较高，它是一种抑制性神经递质［15-20］。作为人体的内源性活性物质，5-HT 与人体很多生理病理活动密切相关。文献表明单胺类神经递质5-HT 具有重要的中枢性镇咳作用［3，21］，可作用于 5-HT1B/D 受体产生镇咳作用。5-吲哚乙酸（5-HIAA）是5-HT 酸代谢的最终产物。去甲肾上腺素（NE）参与5-HT的分泌调节，NE可通过胞体和树突区域里的α1 受体对5-HT 的释放进行正反馈调节作用，当α1 受体与NE 结合时，将刺激5-HT能神经元释放5-HT［22-23］。本研究发现止得咳颗粒可提高小鼠脑组织中5-HT、5-HIAA、NE的含量，提示止得咳颗粒可能是通过直接或间接促进5-HT 的释放产生中枢镇咳作用。任何导致气道血浆渗出增加的化学物质如组胺、缓激肽或P 物质均可间接刺激咳嗽传入神经感受器而诱发咳嗽［24］。多种理化刺激能诱导P 物质释放，从而刺激咳嗽传入神经感受器和C 纤维诱发咳嗽［25］。止得咳颗粒可降低小鼠血清及肺组织中P 物质含量，提示该制剂可能通过抑制P 物质释放而发挥其外周镇咳作用。

中医注重整体观念，讲究标本兼治，中成药制剂成分复杂，靶点多，可以整体调理患者的机体，提高全身免疫力，减少反复发作。本研究发现止得咳颗粒有明显的止咳和抗炎作用，与5-HT、5-HIAA、NE 和P 物质含量的变化有关，初步揭示了止得咳颗粒治疗咳嗽的可能作用机制和靶点。