黄芪甲苷对STZ诱导的1型糖尿病小鼠肾组织galectin-3/ERK1/2信号通路的影响

★ 宋高峰 翁文慈 王文静 彭玲（.深圳市中医院肾病科 广东 深圳 58033；.广州中医药大学第四临床医学院 广东 深圳 58033）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见且严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾病的主要原因，严重影响患者的生活质量［1］。DKD的发病机制甚为复杂，涉及血流动力学异常、线粒体功能失调、脂代谢紊乱、晚期糖基化终末产物（AGEs）形成增加、氧化应激等多种因素，目前尚缺乏特效的治疗药物。

半乳糖凝集素-3（galectin-3）是半乳糖结合素家族的的重要成员之一，主要由巨噬细胞分泌，其在细胞黏附、增殖、活化和凋亡等方面发挥着重要的调节作用，参与了炎症及纤维化等病理过程，可能成为癌症、免疫炎性及代谢性疾病治疗的新型靶标［2］。研究表明，galectin-3与DKD关系密切。galectin-3与DKD患者尿蛋白及血肌酐存在显著相关性，随着病情的加重，galectin-3在血清中的表达逐渐升高，其表达量与尿蛋白呈正相关，与血肌酐呈负相关［3］。galectin-3可能参与了DKD的发生、发展，但其具体作用机制目前尚不明确。

黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是黄芪药理活性的主要成分之一，近年来AS-Ⅳ的肾脏保护作用越来越受到重视。AS-Ⅳ可通过抗氧化［4］、减轻炎症反应［5］等多种作用机制发挥保护肾功能、减轻蛋白尿，治疗DKD的作用。然而AS-Ⅳ对DKD的保护作用是否与调控galectin-3有关尚未见报道。本研究基于galectin-3/ERK1/2信号通路进一步研究AS-Ⅳ对小鼠DKD的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5～6 周龄雄性 C57BL /6J小鼠，体重为 16～18 g，购自广东省医学实验动物中心。

1.2 主要药物与试剂

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美国Sigma-Aldrich公司）；AS-Ⅳ（成都康邦生物科技有限公司）；galectin-3一抗（美国abcam公司）；p-ERK1/2一抗（美国Cell Signaling Technology公司）；尿白蛋白ELISA试剂盒（美国Bethyl公司）；β-actin抗体（美国Sigma-Aldrich公司）；二抗（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.3 主要仪器

垂直电泳仪、转膜仪、全自动凝胶成像和化学发光图像分析系统（美国Bio-Rad Laboratories公司）；荧光显微镜及成像系统（日本NIKON公司）；血糖仪及试纸（瑞士Roche公司）。

1.4 造模与分组

C57BL/6J小鼠30只，适应性饲养1周后，采用随机数字表法，取10只为正常组，其余20只为模型组。造模前禁食不禁水12 h，糖尿病模型组小鼠给予一次性腹腔注射STZ（溶解于0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，pH值4.6，200 mg/kg），正常对照组注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液，于72 h后小鼠尾静脉取血测血糖，随机血糖＞16.7 mmol/L，则确认模型成功。剔除血糖未达标的小鼠。取造模成功的小鼠，采用随机数字表法，分为模型组（STZ组，n=6），AS-Ⅳ治疗组（STZ+AS-Ⅳ组，n=6）。另外从正常小鼠选组6只作为对照组（Control组）。Control 组和STZ组给予标准饲料喂养，STZ + AS-Ⅳ组给予添加AS-Ⅳ的饲料喂养（按5 g∶1 kg比例将AS-Ⅳ和饲料混匀，塑形封装后经钴60照射），共计观察8周。

1.5 标本采集及保存

在给药8周后，于实验动物处死前1 d将各组大鼠分别放置于代谢笼中，收集24 h尿液并记录尿量，采集小鼠8周时血清及肾脏组织标本。步骤如下：水合氯醛麻醉后，摘除眼球快速留取血液标本1 mL，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，取血清装入1.5 mL EP管中，-80 ℃冻存备用。取血结束后立即断颈处死，沿腹正中线剖开腹腔，取出肾脏，去掉被膜，滤纸吸干血迹后左肾纵向切为两半，取一半置于10%中性甲醛固定做病理检查。另一半及右肾组织分离皮髓质后装入1.5 mL EP管中，液氮快速冷冻后保存于-80 ℃超低温冰箱，用于Western blotting检测。

1.6 标本检测

血肌酐及尿素氮由深圳市中医院检验科检测，尿白蛋白使用ELISA方法测定，各组小鼠禁食6 h后用罗氏血糖仪测定空腹血糖，各指标检测均按照相应的试剂盒说明书进行操作。免疫组化染色鉴定galectin-3及p-ERK1/2在肾组织中的表达定位，Western blot方法检测肾皮质组织中galectin-3、p-ERK1/2的蛋白含量。

1.7 肾组织病理学检查

肾组织石蜡切片行PAS染色后，每组随机选取3个样本，使用荧光显微镜下测量30个肾小球血管襻面积，用成像系统拍照，将拍好的照片导入计算机中，用NIS-Elements图像处理软件（Nikon Corporation，Tokyo，Japan）进行图片统计分析。

1.8 免疫组化检测肾组织galectin-3及p-ERK1/2表达

（1）石蜡切片进行脱蜡；（2）抗原用柠檬酸缓冲液修复；（3）3%双氧水（H2O2）灭活内源性过氧化物酶；（4）galectin-3（1∶100），p-ERK1/2（1∶200）4 ℃孵育过夜；（5）37 ℃复温，PBS 洗涤，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育 30 min；（6）PBS 洗涤，DAB显色；（7）苏木素复染，中性树胶封片。

1.9 Western blot检测肾组织galectin-3，p-ERK1/2蛋白的表达

（1）取冷冻保存的小鼠肾皮质组织，称重，加入适量蛋白裂解液，冰上匀浆，在4 ℃下12 000 r/min条件下离心10 min后取上清液提取总蛋白，以BCA方法对上清进行蛋白定量；（2）制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳至溴酚蓝跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上；（3）TBS 洗膜，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h；（4）根据目的蛋白分子量裁剪条带，分别加入稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜；（5）次日用TBS液洗涤条带4次，每次10 min，加入二抗室温下孵育1 h；（6）TBS液洗4次，每次10 min，之后在Bio-Rad全能成像仪上观察、分析条带；（7）β-actin作为内参，以目的蛋白灰度值／内参灰度值反映蛋白的相对表达水平。

1.10 统计学方法

应用SPSS 17.0软件分析系统进行统计学处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，当数据符合正态和方差齐时，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS-Ⅳ对STZ诱导的1型糖尿病小鼠24 h尿白蛋白的影响

与Control组比较，STZ组小鼠24 h尿白蛋白明显升高（P＜0.001）；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组小鼠24 h尿白蛋白明显下降（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠24 h尿白蛋白比较

2.2 AS-Ⅳ对STZ诱导的1型糖尿病小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖的影响

与Control组比较，STZ组小鼠血肌酐升高，但差异无统计学意义；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组小鼠血肌酐明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Control组比较，STZ组小鼠血尿素氮明显升高（P＜0.01）；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组小鼠血尿素氮未见明显下降。与Control组比较，STZ组小鼠血糖明显升高（P＜0.001）；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组小鼠血糖无明显差异。见表1。

表1 各组小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖比较（±s，n=6）

表1 各组小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖比较（±s，n=6）

注：与Control组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与STZ组比较，#P＜0.05。

组别 血肌酐/（μmol·L-1）血尿素氮/（mmol·L-1）血糖/（mmol·L-1）Control组 12.67±1.37 12.80±1.04 7.25±0.93 STZ 组 15.50±4.09 17.03±2.91** 30.63±4.10***STZ+AS- Ⅳ组 11.17±2.23# 17.25±3.79 32.89±5.97

2.3 AS-Ⅳ对STZ诱导的1型糖尿病小鼠肾组织galectin-3/ERK1/2信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot结果所示，与Control组比较，STZ组肾皮质组织中galectin-3蛋白表达明显增加（P＜0.001）；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组肾皮质组织中galectin-3蛋白表达被抑制（P＜0.001）。与Control组比较，STZ组肾皮质组织中p-ERK1/2蛋白表达明显增加（P＜0.01）；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组肾皮质组织中p-ERK1/2蛋白表达被抑制（P＜0.001）。见图2。免疫组化染色结果显示galectin-3主要表达于肾小球中，肾小管中未见表达。见图3。p-ERK1/2主要表达在肾小球中，肾小管亦有少量表达。见图4。

图2 各组小鼠肾皮质中galectin-3与p-ERK1/2蛋白Western blot结果

图3 各组小鼠肾皮质galectin-3免疫组化染色结果

图4 各组小鼠肾皮质p-ERK1/2免疫组化染色结果

2.4 AS-Ⅳ对STZ诱导的1型糖尿病小鼠肾组织病理学形态的影响

对肾脏组织切片分别进行PAS染色可见Control组肾内结构清晰完整，形状规则，肾小球系膜基质未见增生；STZ组中可见系膜基质增多，系膜扩张，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与STZ组比较，STZ+AS-Ⅳ组系膜基质沉积程度明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5-6。

图5 各组小鼠肾组织切片PAS染色

图6 各组小鼠肾小球系膜基质面积比较

3 讨论

肾小球肥大是DKD早期的形态学特征表现，是引起肾脏结构不可逆改变的始动因素，是最终引起终末期肾病的初始病理表现。在这一变化中，肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）聚集起了重要的作用。作为AGEs的受体之一，galectin-3与糖尿病及其并发症关系密切，galectin-3通过其介导的免疫炎症反应及AGEs受体作用等多种生物学效应参与了DKD的发生、发展，可能成为该病治疗的潜在新靶点。研究表明，galectin-3在2型DKD中的表达较正常人明显增多，且与蛋白尿呈正相关，与肾功能呈负相关，galectin-3与2型DKD的进展呈独立相关性［3］。与其他肾脏疾病比较，DKD患者肾组织内galectin-3的表达明显升高［6］。Galectin-3在 DKD高糖培养的肾小球系膜细胞中表达显著上调，高表达的galectin-3可促进系膜细胞的增殖［7］。与既往研究一致，本研究显示1型糖尿病小鼠肾小球存在系膜细胞增殖及系膜基质增生，肾皮质组织中galectin-3蛋白含量显著增加，这提示糖尿病系膜基质增生可能与galectin-3的高表达有关。

ERK1/2信号通路在DKD的发生、发展过程中发挥重要作用。ERK1/2信号通路的活化可导致DKD早期ECM增生［8］。高糖刺激下肾小球系膜细胞ERK1/2信号通路被激活，可促进ECM的合成并抑制其降解［9］。高糖环境下多种细胞因子均可激活ERK1/2信号通路，galectin-3可能是激活ERK1/2信号通路的重要细胞因子之一。既往研究表明: galectin-3的下调导致MEK/ERK信号通路活性降低，并抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭［10］。Galectin-3可通过激活MEK/ERK信号通路促进体外高糖培养的系膜细胞的增殖，沉默galectin-3后，MEK/ERK信号通路受到抑制［11］。本研究结果显示1型糖尿病小鼠肾组织中ERK1/2信号通路存在显著活化，galectin-3可能通过提高ERK1/2磷酸化水平，激活ERK1/2，从而调控DKD肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的增生，进而影响DKD的发生、发展。

AS-IV是黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫调节、抗氧化、清除氧自由基、降血糖及抗衰老等多种药理作用［12］。越来越多的研究表明，AS-IV对DKD肾脏具有保护作用，其保护作用与抑制MEK1/2-ERK1/2-RSK2信号通路［13］、减轻炎症反应［5］、抑制足细胞凋亡［14］、调节线粒体质量调控［15］等多种机制有关。在本研究中首次发现AS-Ⅳ对galectin-3、ERK1/2均有显著抑制作用，这提示AS-Ⅳ对DKD肾脏的保护机制可能与抑制galectin-3/ ERK1/2信号通路有关。

综上所述，AS-Ⅳ对STZ诱导的1型糖尿病小鼠肾脏有明显的保护作用，可减少蛋白尿，减轻肾组织损伤，其作用机制可能与抑制galectin-3/ERK1/2信号通路，进而抑制肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的增生有关。该研究为AS-IV防治DKD提供了新的证据及可能靶点。