施氮量和株高采收时期对油蔬两用型油菜菜薹糖分积累的影响

任 韵 柳 寒 朱建方 林宝刚 李路朋 华水金,*

(1 湖州市农业科技发展中心/湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313000；2 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021；3 龙岩市永定区农业农村局，福建 龙岩 364100)

植物组织糖分的积累受农艺措施如施氮量的调控，而施氮量对糖分积累的影响与作物组织和发育时期密切相关，如施氮降低了水稻茎鞘[1]、黑麦草叶片[2]、红菜薹[3]和抽薹期油菜茎秆[4]等非结构性可溶性糖等糖类物质的积累量。前人研究表明，增施氮肥对玉米穗位叶果糖含量影响不大，但能提升蔗糖含量，降低淀粉含量；吐丝前，增施氮肥虽能提高发育的玉米果穗果糖和葡萄糖含量，但会降低蔗糖和淀粉含量；进入灌浆期，增施氮肥会显著降低发育籽粒果糖和葡萄糖含量，但会迅速增加籽粒中淀粉含量，为籽粒积累干物质提供物质基础，最终达到增产的目的[5]。同时，施用氮肥还能调节碳水化物对作物源-流-库的运转系统从而影响作物产量。Yan等[6]发现施用氮肥会降低油用亚麻开花前叶片中的可溶性糖含量，促进茎秆可溶性总糖和淀粉含量，但纯施氮肥(以施氮量为0 kg·hm-2为对照)会降低叶片和茎秆中非结构性糖向种子的转移效率，即降低“流”效率，增加无效蒴果数量，最终导致产量下降。由此可见，施用氮肥对作物糖分积累的调控是一个复杂的过程。目前，施氮量对菜薹糖分积累的调控机制鲜有报道。

油菜薹发育过程中会积累大量糖分，这些糖分具有多重作用，如增加油菜薹甜度，提升其口感[7-9]，为菜薹增粗和伸长提供能量物质等[10-11]。油菜抽薹是一个动态过程，糖分也处于合成-同化-运转的动态平衡过程，因此，不同株高采摘的油菜薹中糖分含量也可能存在差异。为明确施氮量和采薹株高对油菜薹糖分积累的影响，本研究以油蔬两用型油菜品系富硒1号为材料，比较不同施氮量和采收株高对油菜薹碳水化合物含量的影响，并分析碳水化合物代谢相关酶活性和关键基因的表达量，旨在为油菜薹合理施用氮肥和确定合适的采摘时期提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料和试验地条件

供试材料为浙江省农业科学院油菜育种与栽培研究室提供的中熟型油蔬两用型油菜品系富硒1号。浙江地区菜薹采收期在2月中旬；菜薹产量为450～500 kg·hm-2； 菜薹硒含量为12～15 μg·kg-1(鲜重)。试验在浙江省杭州市余杭良渚麟海蔬果专业合作社开展。前茬作物为水稻，土壤主要养分含量为：全氮 635.0 mg·kg-1、 速效磷 74.5 mg·kg-1、速效钾99.2 μg·kg-1。 试验于2018年10月5日播种，穴直播，每穴播种5粒种子左右。幼苗达到三叶一心时间苗1次，五叶期时定苗。油菜生长期内水分、病虫害管理同常规。

1.2 试验设计与实施(含采样制样)

采用裂区试验设计，主处理为3个施氮量：施用纯氮120、180和240 kg·hm-2(分别以N1、N2和N3表示)；副处理为4个菜薹采收株高：株高20、30、40和50 cm(分别以H1、H2、H3和H4表示)。试验设置3次重复。小区面积13 m2，种植密度为120 000株·hm-2。 氮肥(尿素)按照纯氮量进行折算施用量，分3次均匀施入土壤：60%作为基肥，10%作为提苗肥(五叶期)，30%作为薹肥；磷肥(过磷酸钙，870 kg·hm-2)、 钾肥(氯化钾，200 kg·hm-2)和硼肥(硼砂，15 kg·hm-2)作为基肥一次性施入土壤中。

土壤取样：油菜地翻耕前采用“S”形法取土样用于养分检测。菜薹采样标准：当小区75%的植株达到采样株高时，每小区随机选择60株油蔬两用型油菜(小区边界植株除外)，从花蕾顶部往下切取10 cm长的菜薹。采摘的菜薹分两部分，一部分置于装有碎冰块的保温泡沫盒，立即运回油菜育种与栽培实验室，进行糖分检测。另一部分油菜薹立即置于液氮中冷冻后运回实验室，并于-80℃超低温冰箱保存，用于酶活性检测和基因表达分析。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤养分含量测定 土壤全氮采用凯氏定氮法测定；速效磷采用钼锑抗比色法；速效钾采用火焰光度计法[12]。

1.3.2 可溶性糖组分测定 果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉含量采用蒽酮比色法[13-14]，海藻糖和山梨醇含量采用试剂盒检测(HT-2-Y和SC-2-Y，苏州科铭生物技术有限公司)。

1.3.3 可溶性糖代谢相关酶活性测定 转化酶(invertase，INV)、蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)活性分别按照文献[15-17]所述方法测定。

1.3.4 蔗糖和淀粉代谢途径关键基因表达分析 选择蔗糖和淀粉代谢途径中关键基因进行表达量分析。蔗糖和淀粉代谢关键基因的序列在油菜基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中查找，然后设计引物，引物序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。油菜薹RNA提取、反转录以及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)按照文献[18]的方法进行。以油菜ACTIN作为参考基因，采用2-ΔΔCt方法[19]进行基因相对表达量计算。比较不同施氮量对油菜薹蔗糖和淀粉代谢关键基因表达量时，以120 kg·hm-2处理下油菜薹基因表达量作为对照(即以120 kg·hm-2处理下油菜薹基因表达量为1，其余氮肥处理下油菜薹基因表达量相对于120 kg·hm-2处理下油菜薹基因表达量的倍数)；比较不同采收株高油菜薹蔗糖和淀粉代谢关键基因表达量时，以株高20 cm处理下油菜薹基因表达量为对照。

表1 油菜薹蔗糖和淀粉代谢关键基因qRT-PCR分析引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR analysis of sucrose and starch metabolism in rapeseed

1.4 统计分析

试验中不同氮肥和采收株高处理下油菜薹的果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、海藻糖、山梨醇含量，INV、SS、SPS活性以及编码碳水化合物代谢关键酶基因的表达量均采用平均值计量。统计分析时以施氮量为主处理，采收株高为副处理，通过裂区试验设计方法进行方差分析。各平均值之间的差异采用Duncan’s法分析。基因表达采用R语言软件包进行热图分析。

2 结果与分析

2.1 施氮量和采收株高对油菜薹糖分含量的影响

不同施氮量和采收株高对油菜薹糖分含量的影响见表2。就不同施氮量对油菜薹糖分含量的影响而言，淀粉平均含量随着施氮量的增加而降低，其余糖分平均含量则随着施氮量的增加先升高后降低。果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和山梨醇平均含量在施氮量为180 kg·hm-2时较施氮量120 kg·hm-2处理分别增加了16.19%、27.61%、18.52%、45.91%和43.25%，较施氮量240 kg·hm-2处理分别增加了15.09%、10.22%、33.33%、28.89%和61.40%。表明油菜薹施氮量不宜超过180 kg·hm-2，在此范围内，施氮量对油菜薹糖分含量(淀粉除外)具有促进作用，而超过此范围则对油菜薹碳水化合物含量的积累具有一定的抑制作用。

就不同采收株高对油菜薹糖分含量而言，在3个施氮量处理下，果糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉含量分别在采收株高20 cm时最高(除果糖含量在施氮量240 kg·hm-2处理下，采收株高50 cm时最高)；在采收株高30～50 cm时，这4种糖分含量总体趋势表现为随着采收株高的增加而增加，但未能恢复到采收株高20 cm处理下的含量。海藻糖和山梨醇含量均表现为采收株高40 cm时最高，其他采收株高下这2种糖含量差异较小。

表2 不同施氮量和采收株高对油菜薹糖分含量的影响Table 2 Effects of nitrogen application rates and plant height during harvesting on the contents of carbohydrate in young stem of rapeseed /(mg·g-1 FW)

2.2 施氮量和采收株高对菜薹碳水化合物代谢关键酶活性的影响

由图1-A可知，INV活性在采收株高20 cm的菜薹中随施氮量的增加而增加，两者的相关系数达到0.999。在采收株高30和40 cm时，菜薹中的INV活性均随施氮量的增加而降低。在采收株高50 cm时，菜薹中INV活性随施氮量的增加先减后增。在采收株高40 cm、施氮量120 kg·hm-2处理下菜薹中的INV活性达到最高，但当施肥量增加至180 kg·hm-2时，该酶活性降低了52.25%。

由图1-B可知，SS活性在采收株高20 cm的菜薹中随施氮量的增加而降低，两者相关系数达到了-0.988。 在采收株高30 cm的菜薹中，施氮量从120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2时，SS活性快速降低，降幅达到49.08%；而施氮量从180 kg·hm-2增加至240 kg·hm-2时，酶活性略有增加。在采收株高40 cm的菜薹中，SS活性随着施氮量的增加表现为先增后减，其增加和减少幅度分别为21.64%和4.91%。采收株高50 cm的菜薹中SS活性随施氮量的增加而增加，两者相关系数达到0.961，但该时期采收的菜薹中SS活性总体最弱。

由图1-C可知，在采收株高20和30 cm时，施氮量从120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2后，油菜薹中的SPS活性分别增加了2.52和3.93倍；但施氮量从180 kg·hm-2增加至240 kg·hm-2后，SPS活性分别降低了57.41%和30.90%。在采收株高40 cm时，菜薹中SPS活性随施氮量的增加而降低，两者相关系数达到了-0.992；其活性较其他3个采收时期弱。在采收株高50 cm时，菜薹中SPS活性随施氮量的增加而增强，两者的相关系数达到了0.980，在施氮量240 kg·hm-2处理下，SPS活性是施氮量120 kg·hm-2处理的1.94倍。

图1 不同施氮量和采收株高对 INV、SS和SPS活性的影响Fig.1 Effects of nitrogen rates and harvesting plant heights on the activities of INV, SS and SPS

2.3 施氮量和采收株高对菜薹碳水化合物代谢关键基因表达量的影响

2.3.1 以施氮量120 kg·hm-2为对照处理 由图2可知，在采收株高20和30 cm时，施氮量对催化蔗糖合成的SPS1/SPS2基因的表达量无影响；在采收株高40 cm时，氮肥促进了该基因的表达，在施氮量180和240 kg·hm-2处理下，该基因的上调量分别达到了3.13和2.14倍；在采收株高50 cm时，施氮量降低了该基因的表达量，下调量分别达到了1.94和4.39倍。

催化蔗糖分解的转化酶系统中A/N-INVA基因的表达仅在采收株高40 cm、施氮量180 kg·hm-2处理下表现为较明显上调；CINV1基因在采收株高30 cm时的施氮量180 和240 kg·hm-2处理以及采收株高40 cm、施氮量240 kg·hm-2处理下正向表达，且表达量较高，分别是施氮量120 kg·hm-2处理的3.47、3.05和4.68倍；CINV2基因较为活跃，在采收株高20和40 cm、施氮量180 和240 kg·hm-2处理以及采收株高30 cm、施氮量180 kg·hm-2处理时该基因正向表达，且上调量明显。在采收株高50 cm时，施氮量对该基因具有下调作用。

催化蔗糖分解的蔗糖合成酶系统中，在采收株高20和30 cm时，施氮量对SUS1/SUS4基因具有强烈的促进作用，是施氮量120 kg·hm-2的2.35～10.37倍；在采收株高40 cm以上时，施氮量对该基因起负向调控作用。在采收株高20 cm时，施氮量对SUS3基因的表达具有下调作用；但在采收株高30 cm以上时，施氮量会促进该基因的表达，尤其在采收株高30 cm、施氮量180 kg·hm-2处理下，比施氮量120 kg·hm-2处理的表达量增加了9.61倍。

ADG1基因在采收株高30 cm时，施氮量180和240 kg·hm-2处理下呈现强烈的正向表达，施氮量180 kg·hm-2处理下ADG1的表达量最高，是施氮量120和240 kg·hm-2处理的13.30倍和2.14倍。ADG2基因的表达量在采收株高40 cm、施氮量240 kg·hm-2处理下非常低，比施氮量120 kg·hm-2处理下调了20倍以上。

注：红色代表上调，蓝色代表下调。下同。以施氮量120 kg·hm-2为对照。Note: Red box represented up regulation and blue box represented down regulation. The same as following. The control was nitrogen application rate at 120 kg·hm-2.图2 不同施氮量和采收株高对菜薹糖代谢相关基因表达量变化Fig.2 The expression amounts of genes encoding carbohydrate metabolism enzymes under different nitrogen application rates and harvesting plant height in young rapeseed stem

注：以株高20 cm为对照。Note: The control was plant height at 20 cm.图3 不同施氮量和采收株高对菜薹糖代谢相关基因表达量变化Fig.3 The expression amounts of genes encoding carbohydrate metabolism enzymes under different nitrogen application rates and harvesting plant height in young rapeseed stem

2.3.2 以采收株高20 cm为对照处理A/N-INVA基因的表达量受采收株高影响较小，其上调和下调量均在2倍以内。CINV1基因表达量在施氮量120和180 kg·hm-2处理下各株高采收时主要表现为下调；在施氮量240 kg·hm-2处理下各株高采收时均表现为上调，且在采收株高40 cm时，该基因的上调量最大，是采收株高20 cm处理的7.34倍。CINV2基因在采收株高50 cm时的所有施氮量处理中均表现为下调。采收株高30和40 cm、施氮量180 kg·hm-2处理下，该基因表现为上调；而在120和240 kg·hm-2处理下，其表达量很低。

SUS1/SUS4和SUS3基因除在施氮量240 kg·hm-2、 采收株高30 cm时，同时呈现很高的表达量，其他采收株高和施氮量处理下表现出较强互补性，即SUS1/SUS4基因表达强时，SUS3基因表达较弱，反之亦然。SPS1/SPS2基因的表达量整体较弱，仅在施氮量120 kg·hm-2、 采收株高50 cm与施氮量180 kg·hm-2、 采收株高30和40 cm时表现为上调。

ADG1基因在不同采收株高和施氮量处理下以下调为主，且在施氮量240 kg·hm-2、株高50cm采收时，该基因的下调量最大，比采收株高20 cm的菜薹降低了12.53倍。ADG2基因在不同采收株高和施氮量处理下均为上调模式。在施氮量120、180和240 kg·hm-2处理下，ADG2基因的表达量随采收株高增加分别表现为增加，降低以及先增加后降低。在施氮量180 kg·hm-2、采收株高30 cm处理下，ADG2基因的表达量最高，是采收株高20 cm的13.48倍。

3 讨论

前人研究表明，施氮量在适宜范围内能够促进作物组织多种糖类物质的积累[20-21]。本试验中，施氮量从120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2，油菜薹果糖、葡萄糖、山梨醇、海藻糖和蔗糖等糖类物质含量增加。油菜薹采摘时处于抽薹初期，该时期油菜对氮肥需求旺盛[22-23]。增施氮肥能够促进油菜叶片等绿色组织光合作用，增强光合产物在叶片和茎秆(包括油菜薹)等绿色组织中的积累[24-25]。然而，并非所有糖类物质都受到氮素的促进作用，如本研究中随着施氮量的增加，菜薹淀粉含量降低。在不同作物中，施氮量对淀粉含量的影响不尽相同。如提升施氮量能够显著提高葡萄幼苗叶片[26]和小麦籽粒[27]的淀粉含量，却降低了水稻籽粒[28]直链淀粉含量。这也反映出作物器官淀粉含量对施氮量的反馈可能受到作物种类和器官的影响。本研究中，当施氮量进一步增加至240 kg·hm-2时，糖类物质积累均受到了抑制。过量氮肥抑制植物组织糖类物质的积累的现象已有较多研究报道[29-30]。刘娜等[31]指出，较高的施氮量不利于甜菜糖分积累。温志静等[32]研究发现过量氮肥施用导致嘎啦苹果果糖、葡萄糖和蔗糖合成受到抑制，从而影响品质。这些结果说明，高氮肥在提高作物产量和品质上并无预期效应，还有造成肥料浪费、增加生产成本的风险。因此，适宜范围的施肥量是提高作物品质的关键因素之一。

蔗糖是作物重要的光合产物。与蔗糖代谢相关的酶类主要有SPS、SS和INV，其中SPS活性能反映植物体内蔗糖合成能力，SS和INV活性则体现蔗糖分解能力[33-35]。本研究中，在采收株高20 cm下，施氮量从120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2时，菜薹中的SPS活性增强。氮肥促进SPS活性，有利于光合产物的积累。但菜薹中的蔗糖含量随施氮量的增加而降低，可能与叶片中的蔗糖向菜薹的分配效率有关。在氮肥较少的情况下，叶片中合成的光合产物可能提前向菜薹输送，因此检测到了较高的蔗糖含量；施氮量增多时，氮肥促进油菜生物量的积累，但此时薹茎较短，茎秆长度和生物量均较小(以最终株高160 cm计算，其高度仅占12.5%)，仍以叶片生长为重心，因此，氮肥促进植株光合作用，合成的光合产物仍主要停留在叶片，分配至菜薹的量不多，导致菜薹中检测到的蔗糖含量减少。当施氮量超过180 kg·hm-2时，过高的氮肥对SPS活性具有一定的抑制作用，影响了菜薹蔗糖的积累。该现象在其他作物中也有报道[36]。由蔗糖分解的两种酶系统活性可知，INV和SS活性对氮肥响应的趋势相反，在不同施氮量下，两种酶分解蔗糖的活性此消彼长，但对蔗糖的分解起到了相互补偿的作用，这也可能是该阶段油菜薹蔗糖随施氮量增加而降低的原因。随着采收株高的增加，菜薹中的蔗糖含量在各氮肥处理下均远低于采收株高20 cm的菜薹，这可能是由于随着茎秆的伸长，菜薹中大量蔗糖被分解成单糖(如葡萄糖等)运输至菜薹顶部的花蕾供其发育。在各氮肥处理下，采收株高30 cm以上的菜薹中，SPS活性明显低于INV和SS，这也说明此时菜薹中蔗糖的分解能力强于合成能力，导致蔗糖含量降低。

本研究从基因表达水平层面剖析氮肥和采收株高对油菜薹糖分积累的影响，结果发现编码SPS基因SPS1/SPS2的表达量在各施氮量处理下采收株高20～30 cm的菜薹中的表达量很低，说明SPS基因在该阶段菜薹中合成蔗糖的能力并不强，其蔗糖的可能来源主要是其他叶片的运输。采收株高40和50 cm时，SPS1/SPS2的表达量在施氮量240 kg·hm-2处理下比施氮量180 kg·hm-2处理低，说明在高施氮量下SPS1/SPS2的表达量受到了一定的抑制，进而使菜薹中的蔗糖积累受到一定程度的抑制。

4 结论

本研究结果表明，油菜薹中果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和山梨醇含量随施氮量的增加而增加，施氮量超过180 kg ·hm-2后则降低。就不同采收株高而言，菜薹中果糖、淀粉、葡萄糖和蔗糖含量在采收株高20 cm时最高；海藻糖和山梨醇含量在采收株高40 cm时显著高于其他株高采收菜薹处理。菜薹中蔗糖合成代谢系统的SPS活性在各施氮量和株高处理下比蔗糖分解代谢系统的INV和SS活性低。在菜薹各采收时期和施氮量处理下，蔗糖分解体系的蔗糖合成酶SUS1/SUS4、SUS3和转化酶A/N-INVA、CINV1、CINV2等基因的上调模式具有互补性，而对蔗糖合成体系的蔗糖磷酸合成酶SPS1/SPS2基因的表达量影响较小。